本文件描述了化学品蜜蜂（Apis mellfera L.）慢性经口毒性试验（10天饲喂法）的受试物信息、参比物、试验原理、方法描述、试验程序、质量保证与质量控制、数据与报告。 本文件适用于测试和评价化学品对蜜蜂（Apis mellfera L.）的慢性经口毒性。

ICS 13.300;13.020
CCS A 80
中华人民共和国国家标准國
GB/T428802023
化学品
蜜蜂（Apis mellifera L.）
慢性经口毒性试验（10天饲喂法）ChemicalsHoneybee(Apis mellifera L),chronic oral toxicity test(10-day feeding)
2023-08-06发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2023-12-01实施　
GB/T 428802023
1范围
2规范性引用文件 1
3术语、定义和缩略语 1
4　受试物信息
参比物　2
试验原理3
７　方法描述
８　试验程序　4
质量保证与质量控制5
数据与报告 5
参考文献 7　
GB/T42880—2023
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请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的贵任。本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。本文件起草单位：广东中科英海科技有限公司、生态环境部固体废物与化学品管理技术中心、广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)、沈化测试技术(南通)有限公司、厦门市格灵生物技术有限公司、中国检验检疫科学研究院、浙江亚旺科技有限公司。本文件主要起草人：张宏涛、张宝兰、梅承芳、刘纯新、梁慧君、曾国驱、梁志民、张瑞明、张晶、、霍嘉维、汤保华、周丽丽、叶芷君、陈智勇、王哲思。I
GB/T42880—2023
本文件是实验室条件下进行的成年工蜂10d慢性经口毒性试验方法。蜜蜂等授粉昆虫可通过存贮、进食蜂巢中已受污染的食物，或者在污染区域觅食而长期暴露于各种植保产品(PPP）或化学品。为了解决上述潜在的风险，可在实验室给成年工蜂连续10d饲喂经过处理的食物(蔗糖溶液)进行慢性毒性试验研究。采用本文件对混合物开展测试并获得相关数据以达到指定的监管目的之前，宜考虑这样做是否（以及为何)可为达到上述目的提供充分的试验结果。当有法规明确要求可对混合物进行测试时，则无需有此顾虑。
1范围
化学品　蜜蜂(Apis?mellifera?L.)慢性经口毒性试验（10天饲喂法）GB/T 428802023
本文件描述了化学品蜜蜂(Apis mellferaL)慢性经口毒性试验(10天饲喂法)的受试物信息、参比物、试验原理、方法描述、试验程序、质量保证与质量控制、数据与报告。本文件适用于测试和评价化学品对蜜蜂(Apis mellfera L.)的慢性经口毒性。2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T　21845　化学品　水溶解度试验　GB/T　21855化学品　与 pH有关的水解作用试验GB/T22052
GB/T　2
用液体蒸汽压力计测定液体的蒸汽压力温度关系和初始分解温度的方法工业用化学品固体及液体的蒸汽压在10-Pa至10°Pa范围内的测定静态法工业用化学品固体及液体的蒸汽压在10-3Pa至1Pa范围内的测定蒸气压平3术语、定义和缩略语
3.1 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1.1
x%效应致死浓度lethal concentration for x%effectLC.
与对照组相比，在给定的暴露期间内引起x%试验生物死亡的受试物浓度。3.1.2
半数致死浓度
median lethal concentration
经过统计计算，在试验结束时引起50%试验生物死亡的受试物浓度。注：本文件中LC。值表示为每千克食物中有效成分或制剂的含量，mg(或ug)kg3.1.3
半数致死摄食剂量medianlethal dietarydoseLDD。
经过统计计算，在试验结束时引起50%试验生物死亡的受试物摄食剂量。注：本文件中LDD值表示为每只蜜蜂每日摄食有效成分或制剂的剂量，μg(或ng)/(蜂·d)1
GB/T428802023
最低可观察效应浓度lowest observed effect concentration;LOEC与对照组相比，产生的效应有统计学显著性差异的最低试验浓度。注：本文件中LOEC值表示为每干克食物中有效成分或制剂的含量，mg(或μg)/kg：3.1.5
最低可观察效应摄食剂量lowest observed effect dietary dose;LOEDD与对照组相比，产生的效应有统计学显著性差异的最低试验摄食剂量。注：本文件中LOEDD值表示为每只蜜蜂每日摄食有效成分或制剂的剂量，μg(或ngy(蜂·d)。3.1.6
无可观察效应浓度　no observed effect concentration;NOEC未观察到与对照组有统计学显著性差异效应以及接近LOEC 的最高试验浓度。注：如果LOEC无法确定，NOEC可认为大于或等于最高试验浓度。限度试验中，如果试验浓度的效应与对照组无显著性差异，NOEC可认为大于或者等于该限度试验浓度。本文件中的NOEC值表示为每千克食物中有效成分或制剂的含量，mg(或μg)kg
无可观察效应摄食剂量no observed effect dietary dose;NOEDD未观察到与对照组有统计学显著性差异效应以及接近LOEDD的最高试验摄食剂量。注：如果LOEDD无法确定，NOEDD可认为大于或等于最高试验摄食剂量。限度试验中，如果试验摄食剂量的效应与对照组无显若性差异，NOEDD可认为大于或者等于该限度试验摄食剂量。本文件中 NOEDD值表示为每只蜜蜂每日摄食有效成分或制剂的剂量，μg(或ngy(蜂·d)3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
a.i.：有效成分(AvailableIngredient)4
受试物信息
受试物可以是活性物质或者制剂在试验前，应掌握受试物的下列信息：a）纯度；
b）水中溶解度，按照GB/T　21845的规定;c)
受试物在水溶液中的定量分析方法：d)
水解作用，按照GB/T21855的规定；蒸气压，按照 GB/T　22052、GB/T　22228、GB/T 22229 的规定和见 OECD　No,104°。注：测定上述参数的温度在试验报告中予以说明。5参比物
试验中宜使用参比物确保试验蜜蜂的敏感性和试验系统的可靠性。首选参比物为乐果（原药或制剂：CASNo.60-51-5）。参比物的一个浓度宜能导致试验期结束时预期死亡率不小于50%，以证明蜜蜂的敏感性和试验系统的可靠性。有效成分在0.5mg/kg和1.0 mg/kg饲喂液之间的参比物浓度可使蜜蜂慢性暴露后死亡率不小于50%
6试验原理
GB/T428802023
连续10d不限量地饲喂幼蜂（最大2日龄）含有受试物的500gL燕糖水溶液，试验期间每天观察并记录蜜蜂的死亡数及异常行为。通过对比受试物处理组与对照组的试验结果来评价受试物对蜜蜂的慢性效应。对结果进行分析，计算半数致死浓度(LC。）和连续10d暴露后的半数致死摄食剂量(LDD:)，并求出无可观察效应浓度(NOEC）和无可观察效应摄食剂量(NOEDD)。某些情况例如受试物毒性较低或者受试物难溶时，可以进行限度试验，当试验过程中未观察到毒性效应时，说明NOEDD大于或等于限度剂量以及LDD。大于限度剂量。７　方法描述
7. 1 受试蜂
7.1.1用于试验的蜜蜂宜为幼年工蜂，最大2日龄，以保证试验开始时蜜蜂处于相近龄期。应从无病害、来源和生理状态明确、含蜂王的蜂群的子脾中收集。此外，试验前一个月内蜂巢不能施用化学物质，比如抗生素、除螨剂等。如果一个蜂群中收集不到足够的受试峰，可采用其他峰群中的子脾，但需确保所有蜜蜂合理分配至各处理组。同龄期封盖子脾可以放在人工气候箱中孵化，或用隔王产卵器装着，放置蜂箱中直至孵化。第一种方法需要确保该子脾上的蜂蜜和花粉充足，或放入另外一张含有花粉蜂蜜的子脾提供食物。
7.1.2试验前一天，收集从子脾孵出的蜜蜂，并分装到试验蜂笼中，收集过程不能麻醉蜜蜂。蜜蜂（孵出后1d的蜜蜂)应在试验条件下适应1d。适应和试验期间，不限量投喂蜜蜂蔗糖溶液，不需额外饲喂花粉和水。试验前蜜蜂无须饥饿。7.2试验蜂笼
7.2.1使用方便清理或一次性的通风性良好的蜂笼进行试验。试验蜂笼的材质可选用任何合适的材质，如不锈钢、硬纸板、金属丝网、塑料以及一次性木质材质等。7.2.2每笼10只蜜蜂，因为该数量可准确评估有效应蜜蜂与无效应蜜蜂之间的差异。蜂笼的大小需保障10只蜜蜂有足够的活动空间，最小200cm?/10只蜜蜂。7.3饲喂液准备
7.3.1对照组、受试物处理组以及参比物处理组饲喂液均用500 gL的蔗糖水溶液配制。在各个饲喂期(约24h)内，确保所有饲喂液均匀分散且无明显沉淀。7.3.2将受试物配制成备液或直接将受试物用500g糖水溶液混合配制（试验饲喂液）。配制购备液时，若受试物水溶性好，可用去离子水溶解，当其水溶性较差时，可用丙酮作为溶剂。有机溶剂添加的浓度取决于受试物的溶解度，同时确保各处理浓度组添加浓度一致。最终添加的饲喂液中内酮的最大浓度不得超过5%。在满足对照组的有效性标准条件下，任何其他溶剂、增溶剂或增稠剂都可使用，例如用于增加24h饲喂期内饲喂液的均匀性等。依据受试物在溶液中的稳定性，整个试验周期可只配制一次贮备液，并密封冷藏于黑暗环境中(冰箱，6℃±2℃），若受试物在水或丙酮溶液中快速降解，则需每天或适当的时间间隔新鲜配制贮备液。7.3.3最终添加的饲喂液由贮备液或稀释的中间液和500g/L燕糖水溶液配制而成，并至少每4d配制一次，配制后存放于冰箱(6℃土2℃）。7.3.4若使用丙酮，或其他溶剂、增溶剂、增稠剂作为助溶剂时，需设置两个对照组，分别为50%蔗糖水溶液的空白对照组和含有与受试物处理组相同浓度丙酮，或其他溶剂、增溶剂、增稠剂的500gL蔗糖3
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水溶液的溶剂对照组。
7.4分析验证
7.4.1如果每日制备饲喂液，则在试验期间取样一次，在制备后至少取最低浓度饲喂液和最高浓度饲喂液各一等份并储存在小于或等于一18℃的冰箱中，用于分析检测受试物的实际浓度。如果饲喂液由贮备液配制而成，还需再取一份贮备液样品用于分析检测。7.4.2即使贮备液或饲喂液不是每日制备，同样也要进行分析检测。制备后于试验期间取样一次和最长保存期结束时取样一次，至少取最低、最高浓度饲喂液以及贮备液各一份并冷冻保存（小于或等于-18℃）。饲喂液的最长保存期不应超过4d且需冷藏保存。7.4.3若在试验期问使用不同批次的受试物，还需另外再取每一批新受试物的最低和最高浓度的样本进行分析检测。理想情况下，宜使用同一批次的化学物进行研究。8 试验程序
8.1 设置试验组和对照组
8.1.1试验浓度组数和重复数的设置宜满足试验结束时可得出NOEC/NOEDD值，LCo/LDD。（或适当时为LC,/LDD）及95%置信区间的统计学要求。通常，试验至少设置5个浓度组，等比系数不超过2.5,且涵盖LC的范围(某些特殊情况如剂量反应关系较平稳时可采用更大的等比系数)。注：LDD,指与对照组相比，在给定的暴露期间内引起x%试验生物死亡的受试物摄食剂量。8.1.2受试物毒性未知时，可进行预试验以确定正式试验的浓度范围。8.1.3对于剂量-反应试验，每个处理至少3个重复(笼),每个重复(笼)含10只蜜蜂。对于限度试验，空白对照组及受试物处理组设置5个重复(笼，参比物组至少3个重复(笼)。8.2暴露（饲喂）
用饲喂器，如2m或以上的去掉尖端的塑料注射器，不限量供应蜜蜂饲喂液。同一重复中蜜蜂会分享饲喂液，即交哺，因此能认为蜜蜂全部暴露。每日更换饲喂器以及饲喂液，更换间隔为24h(士2 h)。每天通过用校正的天平称量饲喂前后饲喂器的质量以测定饲喂液的消耗量。8.3蒸发
主试验还应额外设置用于校正试验液从饲喂器挥发的试验蜂笼。这些蜂笼不含蜜蜂，只有预先称重的含空百对照饲喂液和/或溶剂对照饲喂液的饲喂器，每个试验最少3个重复，且和试验蜂笼放置在同一试验环境中，这些饲喂器在每日的更换饲喂器操作中也要重新称量以及替换。测定后的食物消耗量减去该蒸发量可得到考虑了蒸发损失的校正食物消耗量。8.4试验条件
8.4.1蜜蜂宜在持续黑暗(观察时除外）、温度为33℃土2℃和相对湿度为50%～70%的受控气候条件下进行试验。与推荐试验条件的短期偏差(每天小于或等于2h)是不可避免的，不影响试验的完整性及结果。
8.4.2宜使用合适且经过校准的设备连续记录温度和湿度。8.5试验时间
蜜蜂连续暴露于饲喂液10d。
8.6观察和测量
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8.6.1从试验开始，即首次饲喂后24h+2h，每天的同一时间（每24 h+2h）记录蜜蜂的死亡数。8.6.2此外，在记录死亡数的同时，记录蜜蜂的异常行为。8.6.3异常行为可根据以下分类进行定量观察。m
频死(蜜蜂不能爬行但四肢和触须有轻微动、对外界刺激如灯光或风的刺激反应弱等，这些情况蜜蜂可恢复但通常会死掉)。受影响（蜜蜂仍能站立和爬行但协调性下降、躁动不安、具有攻击性、自洁行为增加、打转颤抖）。
抽搐(蜜蜂腹部或整个身体收缩)。ap反应冷淡(蜜蜂对外界刺激反应弱或比较慢，比如灯光或风吹的刺激；蜜蜂在笼里趴着不动)。
v呕吐。
8.6.4上述以外的异常行为也宜注意和详细记录。暴露10d后，记录和测定最终死亡数及食物消耗量，然后将装有蜜蜂的试验蜂笼放于不高于-10℃(越低越好)，或采用其他人道方法终止试验。9质量保证与质量控制
在试验结束时，即暴露开始后10d如果满足以下条件，试验结果有效。a
空白对照组各重复的平均死亡广率不超过15%：如果有溶剂对照组，试验结束时溶剂对照组各重复的平均死亡率也应不超过15%。b）参比物质处理组平均死亡率不小于50%。10数据与报告
10.1数据处理
10.1.1宜以表格形式总结数据，包括试验蜜蜂数量、每次观察时的死亡蜜蜂数和异常行为蜜蜂数。试验结束后，选用适当的计方法，可采用回归分析方法或二项式概率法，分析死亡数据，计算出LC。（以mg/kg 表示)和 LDD。［以μg或 ng/（蜂·d)表示],适当时为LC，及其95%置信区间，并求出 NOEC ／NOEDD。可以使用标准程序校正对照死亡率（例如Abbott)。10.1.2食物消耗量数据宜按以下方法计算和表示。.
平均每只蜜蜂每日饲喂液消耗量，mg／蜂；统计每次饲喂开始时的存活蜜蜂数用于上述计算。试验期间每个处理总的日均饲喂液消耗量，mg／（蜂·d)。试验期间每个重复总的日均饲喂液消耗量，mg/（蜂·d)。O
平均每只蜜蜂每日摄食受试物剂量，μg 或ng/(蜂·d)。试验期间每只蜜蜂累计摄食受试物总剂量，μg 或ng/蜂。10.1.3应校正试验液的蒸发量。如果食物消耗量减去蒸发量后为负值，则当天食物消耗量被认为是“0”，表示无食物消耗。
10.2试验报告
试验报告应包括以下内容。
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a）受试物和参比物：bzxz.net
单组分物质：物理性状、水溶解性以及其他相关的物理化学特性；化学特性鉴定，如国际纯，粹与应用化学联合会(IUPAC）或美国化学文摘社(CAS）的系统命名、美国化学文摘社(CAS）登记编码、简化分子线性输入规范(SMILES）或国际化合物标识(InChI）代码、结构式、纯度，在适当情况下还应提供杂质的化学鉴别信息，必要时包括有机碳含量；一多组分物质、UVCBs（成分未知或组分多变的物质、复杂反应产物或生物材料)和混合物尽可能提供各组分的化学鉴别信息(如上）、含量和相关的物理-化学特性；来源、批号、使用期限；
受试物的稳定性(如有)；
受试物在水和溶剂(如有)中的溶解度及稳定性。b）试验系统：试验生物详细信息，包括学名、种属、龄期、孵化及收集方法，还有试验用蜂群的信息，如健康状态、前期处理情况等。c）试验条件：
-孵化、适应期(如适用)及试验阶段的条件；试验蜂笼描述，如类型、材质及尺寸；制备贮备液及饲喂液的方法及频率；试验设计，包括处理组数目(对照组、受试物组、参比物组),重复数，每笼蜜蜂数；试验开始及结束日期。
d）试验结果：
所有处理组每次观察的蜜蜂死亡数；所有处理组各观察期的饲喂液消耗量；一所用的理论试验浓度和饲喂液中受试物的实测浓度及所用的分析方法；蒸发量数据：
试验结束时受试物的LC。/LDD。,NOEC/NOEDD和/或LC,LDD，（如果部分适用）值　及95%置信区间，描述研究中使用的所有统计程序；-其他观察到的生物效应，如异常行为、拒食反应等：一对准则的偏离和其他任何相关信息。6
参考文献
GB/T428802023
[1] OECD(1998).Guideline for the Testing of Chemicals,No.213:Honey bees:acute oraltoxicity test.Organisation for Economic Cooperation and Development,Paris.[2] Kling,A.&.Schmitzer,S.(2015):Proposal for a new OECD guideline for the testing ofchemicals on adult honey bees(Apis mellifera L.)in a 10 day chronic feeding test in the laboratoryand results of the recent ring test 2014.Hazards of pesticides to bees-12th Intemational Symposiumof the ICP-PR Bee Protection Group,Ghent(Belgium),15-17 September 2014.Julius-Kuhn-Archiv.450,pp.69-74.
[3] OECD(2017),Summary of the Results of the 1st International Ring Test for the Standard.isation of a 1o Day Chronic Feeding Test ond Honey Bees(Apis mellifrea L.)in the LaboratoryENV Publication,Series on Testing and Assessment No.277,Paris.[4] Abbott,W.S.(1925).A method for computing the effectiveness of an insecticide.Jour.Econ.Entomol.,18,265-267.
[5] OECD(2017).Guideline for the Testing of Chemicals,No.245:HONEY BEE(APISMELLIFERA L.),CHRONIC ORAL TOXICITY TEST(10-DAY FEEDING).Organisation for Eco-nomic Cooperation and Development,Paris.[6] OECD(2006).Guideline for the Testing ofChemicals,No 104.Vapour Pressure.Organisation forEconomic Cooperation and Development, Paris.
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