本文件规定了化学品急性眼刺激试验的方法原理、仪器与试剂耗材、试验和结果判定。 本文件适用于化学品急性眼刺激性的体外检测，化学品溶于水且受试溶液的pH应在6.5~7.8范围内。

ICS 13.300;11.100
CCS A 80
中华人民共和国国家标准
GB/T43450—2023
化学品
急性眼刺激体外细胞试验
TRPV1活性检测法
Chemicals-In vitro cellular assay for acute eye irritation-TRPV1 activity detection method2023-11-27发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2024-06-01实施
本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则起草。
GB/T43450—2023
第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会（SAC/TC251)提出并归口。本文件起草单位：南京市产品质量监督检验院（南京市质量发展与先进技术应用研究院）、中国药科大学、中国化工经济技术发展中心、中检科健（天津)检验检测有限责任公司、厦门丰力扬科技有限公司、浙江辉日环境检测有限公司。
本文件主要起草人：张驰、强雨薇、曹征宇、李敏、赵芳、杨淼、乔玲、吴肖肖、王灿、纪晗旭、梅秀明、王浩杰、步江涛、徐婧婧、蒋迪尧、李雨枫、刘春艳、王雷、霍健、李振益、王燕。I
1范围
化学品急性眼刺激体外细胞试验TRPV1活性检测法
GB/T43450—2023
本文件规定了化学品急性眼刺激试验的方法原理、仪器与试剂耗材、试验和结果判定。本文件适用于化学品急性眼刺激性的体外检测，化学品溶于水且受试溶液的pH应在6.5～7.8范围内。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682
2分析实验室用水规格和试验方法化学品急性眼刺激性/腐蚀性试验方法GB/T21609
化妆品体外替代试验实验室规范SN/T2285
SN/T3899
化妆品体外替代试验
良好细胞培养和样品制备规范
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1.1
眼刺激性eye irritation
眼球表面接触受试物后产生的眼晴可逆性炎性变化［来源：GB/T21609,3.1]
激动剂
agonist
既有亲和力又有内在活性，能与受体结合并激动受体产生效应的化合物。3.1.3
拮抗剂
Jantagonist
与受体结合后本身不引起生物学效应，但能阻断该受体产生激动效应的化合物。3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
AUC：曲线下面积（AreaUnderCurve）BSA：牛血清白蛋白（BovineSerumAlbumin）DMEM：杜氏改良依格尔培养基（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）1
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DMSO：二甲基亚砜（DimethylSulfoxide）EDTA：乙二胺四乙酸(Ethylenedinitrilotetraacetic Acid)FBS：胎牛血清（FetalBovineSerum）HBSS：Hank's平衡盐溶液（Hank'sBalanced Salt Solution）HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸[4-(2-Hydroxyethyl)-1-PiperazineethanesulfonicAcidPBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferedSaline）TRPV1：瞬时受体电位香草酸亚型1基因（TransientReceptorPotentialVanilloidType-1）TRPV1-HEK293：稳定转染人源TRPV1的人胚胎肾293细胞系（HumanTransientReceptorPotential Vanilloid Type-1 Stable Transfected HEK293 Cell Line)4方法原理
具有眼刺激性的化学品可通过激活TRPV1通道引起钙离子内流，使细胞内钙离子浓度迅速升高。通过测试化学品作用于TRPV1-HEK293细胞后的胞内钙离子浓度的改变，反映TRPV1通道的实时变化，从而定性检测化学品的急性眼刺激性。5仪器与试剂耗材
5.1仪器
Ⅱ级生物安全柜或超净工作台。二氧化碳培养箱：温度为37℃士1℃，二氧化碳体积分数为5%士1%，相对湿度为90%士5%。恒温水浴箱：温度为37℃士1℃。倒置显微镜。
高通量实时荧光检测分析仪。
电子天平：最小分度值为0.1mg。5.1.6
细胞计数仪或血球计数器。
离心机。
混悬仪。
液氮罐。
多道可调微量移液器：30uL～300uL或20uL～200uL，最大允许系统误差为5%，超低温冰箱。
5.2试剂耗材
5.2.1水：实验用水符合GB/T6682一级用水的要求2TRPV1-HEK293细胞系。
5.2.3DMEM培养基：DMEM培养基可选用各种商品供应的粉末培养基按生产厂商提供资料配制，并用0.22μm的滤膜过滤除菌，储存于4℃不超过1个月。5.2.4完全培养基：常规培养时，完全培养基配方为90%DMEM、10%FBS、100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素、1mg/mL遗传霉素（CAS：108321-42-2）。试验时，完全培养基配方为90%DMEM、10%FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素。5.2.5PBS：称取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNazHPO、0.24gKHzPO，溶于900mL双蒸水，调节pH至7.2，用双蒸水定容至1000mL，115℃高压灭菌15min，储存于4℃不超过1个月5.2.60.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA：称取0.05g胰蛋白酶干粉和0.02gEDTA，先加人少量PBS溶2
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液，4℃低速搅拌，完全溶解后调节pH至7.2，用PBS溶液定容至100mL，过滤除菌，储存于一20℃，使用前于37℃预热。
5.2.7Hank's平衡盐溶液：称取8.0gNaCl、0.4gKCl、0.1gMgSO4·7HzO、0.1gMgClz·6H2O、0.06gNa2HPO4·2H2O、0.06gKHzPO4、1.0g葡萄糖、0.14gCaCl2、0.35gNaHCO3,加700mL双蒸水充分混匀，调pH至7.2，用双蒸水定容至1000mL，储存于4℃不超过1个月5.2.8HBSS缓冲液：称取HEPES（CAS：7365-45-9）2.383g，加人Hank's平衡盐溶液定容至500mL，4℃保存备用。
5.2.9辣椒素（Capsaicin）溶液：TRPV1激动剂（CAS：404-86-4）。称取1mg辣椒素溶于3.274mLDMSO中，配制成1mmol/L的母液，一20℃分装保存。使用前取3μL母液，加372μLHBSS缓冲液，即用即配。
5.2.10辣椒平（Capsazepine）溶液：TRPV1拮抗剂（CAS：138977-28-3）。称取5mg辣椒平溶于0.132mLDMSO中，配制成100mmol/L的母液，一20℃分装保存。使用前取10μL母液，加10mLHBSS缓冲液，即用即配。
5.2.11钙离子染料Fluo-4AM溶液：称取1mgFluo-4AM（CAS：273221-67-3），溶于227.9μLDMSO中，配制成4mmol/L的母液，避光保存于一20℃，分装保存。使用前取10μLFluo-4AM母液，加9mLHBSS缓冲液和1mL50mg/mLBSA（CAS：9048-46-8，HBSS缓冲液配制），37℃预热，即用即配。
5.2.120.22um滤器。
5.2.13无菌吸管：规格10mL。
细胞培养瓶：25cm2、75cm2。
5.2.15细胞冻存管。
5.2.1696孔黑色透明平底酶标板（细胞板）。5.2.179
96孔尖底透明酶标板（加样板）。6试验方法
6.1基本要求
细胞培养相关的溶液和器皿等均应无菌，并且所有操作都应在无菌环境和II级生物安全柜或超净工作台中进行。定期检查细胞，确保无微生物污染。细胞由有资质的细胞库提供。细胞培养、传代、冻存应符合SN/T3899的要求，使用25代之内的细胞进行试验。试验过程应符合SN/T2285的要求。6.2试验步骤
6.2.1细胞培养
日常培养时，TRPV1-HEK293细胞使用常规培养的完全培养基在37℃土1℃，二氧化碳体积分数为5%士1%，相对湿度为90%士5%条件下培养。6.2.2细胞接种
当细胞进行了2次～3次传代，显微镜下观察生长状况良好，培养液清澈透明无杂质，细胞无悬浮或微量悬浮，贴壁均匀，胞浆内颗粒少，则可进行细胞接种。使用PBS溶液洗涤细胞3次～4次，加人预热至37℃的0.05%胰蛋白酶（含EDTA)溶液消化细胞，用完全培养基调整细胞浓度以2X104个/孔接种至细胞板的所有细胞孔，每孔150μuL。空白对照孔中不加液体。在细胞培养板的外周孔中加人200μL无菌双蒸水，以减少培养基的蒸发（细胞板分布见图1）。将细胞板置于二氧化碳培养箱中培养3
GB/T43450—2023
过夜。次日，如细胞融合达到培养瓶底壁的85%～90%且形态正常，可进行下一步试验。1
CellHBsS
CellHBSS
CelltmBss
CellHB55
CellHBSs
CellHBSS
Cellpc
Cellpc
Cellpc
Cellpc
Cellpo
Cellpc
Celle-
Cellc-
Cellc+
Cellc+
Cellc+
Cellc-
Cellc-
Cellc+
Cellc+
Celle+
Cellc-
Cellc-
Cellc+
Cellc+
Cellc+
Cellc+
Cellc+
Cellc+
Cellc-
Cellc-
Cellc-
Cellc+
Cellc+
Cellc-
Cellc-
Cellc-
Cellc+
Cellc+
Cellc+
Cellsc
Cellsc
Cellsc
Cellsc
Cellsc
Cellsc
Cell：细胞孔（每孔加入150uL细胞悬液。其中CellHBss为缓冲液对照孔，Cellpc为阳性对照孔，Cellc-为受试样品无辣椒平孔，Cellc+为受试样品加辣椒平孔，Cellsc为溶剂对照孔），HO：外周孔（每孔加入200uL无菌双蒸水）。BL：空白对照孔（不加液体）。图1细胞板分布图
6.2.3染料孵育
吸取移除细胞板所有细胞孔内的培养基，加入60uL钙离子染料F1uo-4AM，于二氧化碳培养箱中孵育45min～60min。孵育结束后，每孔加人140μLHBSS缓冲液，此时每孔溶液总体积为200μL。吸取移除150μL孔内溶液，再轻柔缓慢地加人150uLHBSS缓冲液，避免吹起贴壁的细胞，重复该步骤5次～6次。除受试样品加辣椒平孔（Cellc+）外，其余细胞孔在最后一次移除150μuL孔内溶液后，加入125μLHBSS缓冲液，此时每孔溶液总体积为175μL。受试样品加辣椒平孔（Cellc+）在最后一次洗涤完成后，移除孔内所有溶液，加入175μL辣椒平溶液（5.2.10）。室温下静置5min。上述所有操作均应避光。
6.2.4样品制备
受试物可为实验纯以上纯度的单一化学品或若干化学品组成的混合物。对于液态受试样品，一般不需稀释，可直接使用原液。若受试样品为固体、颗粒或粉末，应将其粉碎，研细。试验前预先测试受试物的溶解性，可选择的溶剂包括HBSS、DMSO、PBS等。液体受试物可以使用原液作为受试溶液。
取3uL受试溶液.加入372uLHBSS缓冲液，充分混勾，加人加样板的一列受试样品孔中，每孔60μL。每板可同时测试6个样品（C1～C6）。缓冲液对照孔（HBSS)每孔加人60μLHBSS缓冲液。阳性对照孔（PC)每孔加入60μL辣椒素溶液（5.2.9）。溶剂对照孔（SC）每孔加人60μL含与受试样品孔中相等体积溶剂的HBSS缓冲液（以溶剂为DMSO为例，取3uLDMSO加人372uLHBSS缓冲液，充分混匀后每孔加人60uL）。当受试物为液体原液时，可不设溶剂对照孔。加样板分布见图2。4
HBSS：缓冲液对照孔（每孔加入60uLHBSS缓冲液），PC：阳性对照孔（每孔加人60uL辣椒素溶液）。7
C1～C6：受试样品孔（每列为同一浓度样品，每孔加人受试样品溶液）。9bzxz.net
SC:溶剂对照孔（每孔加人60μL含与受试样品孔中相等体积溶剂的HBSS缓冲液）。图2加样板分布图
6.2.5测试
GB/T43450—2023
6.2.5.1分别将细胞板和加样板放置于高通量实时荧光检测分析系统的相应位置，设定激发波长范围为470nm～495nm，测定波长范围为515nm～575nm，荧光信号采集间隔为1s，加样体积为25uL。6.2.5.2测试开始后，先不加样品，连续检测细胞板的基线荧光强度60S，以最初10个时间点荧光信号的平均值作为基础荧光强度值（F。）。随后，自动加样并连续检测荧光强度值（F）740S，检测时间共800S。对于空白对照孔、溶剂对照孔、缓冲液对照孔、阳性对照孔、受试样品无辣椒平孔和加辣椒平孔，分别计算每个测试时间点各孔的相对荧光强度F/F。。计算样品有/无辣椒平组及对照组的复孔在每个测试时间点的相对荧光强度平均值F/F。，形成时间一F/F。曲线，计算时间一F/F。曲线60s～800s的AUC。见公式（1）～公式（6）。6.3二次测试
当首次测试的结果出现7.4的情况，则进行二次试验。试验步骤按6.2进行，但在样品制备时，将受试溶液以3倍梯度稀释为6个浓度，分别加人加样板的C1孔～C6孔中。测试完成后，计算不同浓度受试物时间一F/F。曲线60s～800s的AUC。见公式（1）～公式（6）。6.4结果计算
空白对照组激动效果以EBL计，按公式（1)计算：F elmx/F。×100%
式中：
F BLmax
空白对照的平均荧光强度最大值，单位为相对荧光单位（RFU）；基础荧光强度值，单位为相对荧光单位（RFU）。（1）
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溶剂对照组激动效果以Esc计，按公式（2)计算：Esc
式中：
FsCmax
Fscmax/F
溶剂对照的平均荧光强度最大值，单位为相对荧光单位（RFU）；基础荧光强度值，单位为相对荧光单位（RFU）。阳性对照组激动效果以Epc计，按公式（3)计算：Epc
式中：
Fpcmax
Fpcmx/F。
阳性对照的平均荧光强度最大值，单位为相对荧光单位（RFU）；F。
基础荧光强度值，单位为相对荧光单位（RFU）。缓冲液对照组激动效果以EHBSs计，按公式（4)计算：EHBSS
式中：
FHBSSma
FHBSsmax/F。
×100%
缓冲液对照的平均荧光强度最大值，单位为相对荧光单位（RFU）：F。
基础荧光强度值，单位为相对荧光单位（RFU）。受试样品的激动效果以Ec-计，按公式（5)计算：AUCHBSS×100%
式中：
AUCHBSS
AUCc-—
AUCpc-AUCHBSS
受试样品无辣椒平的AUC值：
缓冲液对照的AUC值：
阳性对照的AUC值。
辣椒平溶液对于受试样品的拮抗效果以Ec+计，按公式（6)计算：AUCHBSS ×100%
式中：
AUCHESS
结果判定
AUCc+—
AUC_-AUCHESS
受试样品加辣椒平的AUC值；
缓冲液对照的AUC值；
受试样品无辣椒平的AUC值。
（2）
（3）
（4）
+（5）
.（6）
7.1首次测试时，如EBl小于或等于110%、Esc小于或等于110%、EHBss小于或等于110%，同时Epc大于200%，试验结果有效。
7.2当受试样品的Ec-小于20%，样品无急性眼刺激性。7.3当受试样品的Ec-大于或等于20%，且Ec+小于或等于75%，样品具有潜在的急性眼刺激性。7.4当受试样品的Ec-大于或等于20%，但Ec+大于75%，则应按6.3进行二次测试。二次测试的结果中，受试样品任一浓度的Ec+小于或等于75%，样品具有潜在的急性眼刺激性。7.5若测试结果不符合7.1～7.4，应按照GB/T21609或其他试验方法检测。6
参考文献
GB/T43450—2023
[1] Forsby A,Norman K G,Andaloussi-Lilja J E L,et al. Using novel in vitro nociocular assaybased on trpvl channel activation for prediction of eye sting potential of baby shampoos. ToxicolSci.2012,129(2)：325-331
[2] Lilja J,Lindegren H and Forsby A. Surfactant-induced TRPV1 activity-A novel mechanism foreye irritation？Toxicol Sci.2012,99(1):174-180[3] Narda M,Ramos-Lopez D,Mun G,et al.Three-tier testing approach for optimal ocular tolerancesunscreen.Cutan Ocul Toxicol.2019,38(3):212-220[4] Zhao F, Wang SY,Li Y,et al. Surfactant cocamide monoethanolamide causes eye irritationby activating nociceptor TRPV1 channels.Brit J Pharmacol. 2021,178(17):3448-3462
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