本文件描述了EIA的临床诊断、实时荧光PCR、病毒分离与鉴定、琼脂凝胶免疫扩散试验、间接ELISA、竞争ELISA、免疫印迹试验的方法。 本文件适用于EIA的诊断、检疫、监测和流行病学调查。

ICS11.220
CCSB41
中华人民共和国国家标准
GB/T17494—2023
代替GB/T17494—2009
马传染性贫血诊断技术
Diagnostic techniques for equine infectious anemia2023-09-07发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2024-04-01实施
规范性引用文件
术语和定义
缩略语
实验室生物安全措施
临床诊断
样品采集、保存与运输
实时荧光PCR.·…
病毒分离与鉴定
琼脂凝胶免疫扩散试验
间接ELISA
竞争ELISA
免疫印迹试验
综合判定
附录A（规范性）
附录B（资料性）
附录C（资料性）
试剂的配制
实时荧光PCR引物和探针
实时荧光PCR阳性对照质粒的制备GB/T17494—2023
GB/T17494—2023
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件代替GB/T17494—2009《马传染性贫血病间接ELISA诊断技术》，与GB/T17494—2009相比.除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下：增加了马传染性贫血临床诊断（见第6章）：增加了马传染性贫血病毒实时荧光PCR检测（见第8章）：—增加了马传染性贫血病毒分离与鉴定（见第9章）；—增加了马传染性贫血琼脂凝胶免疫扩散试验（见第10章）；更改了马传染性贫血间接ELISA（见第11章，2009年版的第4章、第5章）；增加了马传染性贫血竞争ELISA（见第12章）：增加了马传染性贫血免疫印迹试验（见第13章）：请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出。本文件由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。本文件起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心中华人民共和国广州海关、中国农业大学、中华人民共和国北京海关。本文件主要起草人：胡哲、王晓钧、郭巍、林跃智、王雪峰、王文、陈茹、王勤、柏亚铎。本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：2009年首次发布为GB/T17494—2009：一本次为第一次修订。
GB/T17494—2023
马传染性贫血（EquineInfectiousAnaemia，EIA）是由反转录病毒科、慢病毒属成员马传染性贫血病毒（EquineInfectiousAnaemiaVirus，EIAV）引起的马、驴、等马属动物传染病。该病被世界动物卫生组织（WorldOrganizationforAnimalHealth，WOAH)列为通报性疫病，是我国《一，二、三类动物疫病病种名录》(2022)规定的二类动物疫病。EIAV只感染马属动物，其中马最易感。感染动物是主要的传染源。EIAV感染宿主后·病毒将自身基因组整合到宿主细胞基因组，造成宿主持续感染和终身带毒。临床上发病动物可表现为反复发热、贫血、黄疽、出血、水肿和消瘦等特征，但一定比例的马和大多数驴、骤感染后不表现明显的临床症状，成为隐性病毒携带者。本病目前没有适用的疫苗。本病的确诊需要依靠实验室诊断。EIAV属于反转录病毒，EIAV进入宿主细胞后复制早期在病毒反转录酶的作用下形成双链病毒DNA（通常称为前病毒DNA)，前病毒DNA在病毒编码的整合酶的作用下进一步整合到宿主染色体上。EIAV前病毒DNA在感染宿主体内相对稳定，常常作为病毒核酸检测的靶标。世界上不同地区EIAV基因组序列存在较大差异，本文件采用的核酸检测方法为适用于目前不同毒株的通用型实时荧光PCR方法1范围
马传染性贫血诊断技术bzxZ.net
GB/T17494—2023
本文件描述了EIA的临床诊断、实时费光PCR、病毒分离与鉴定、琼脂凝胶免疫扩散试验、间接ELISA、竞争ELISA、免疫印迹试验的方法。本文件适用于EIA的诊断、检疫、监测和流行病学调查。2
规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用本文件。
GB/T6682
分析实验室用水规格和试验方法实验室生物安全通用要求
GB19489
NY/T541
术语和定义
兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BCA：二辛可宁酸（BicinchoninicAcid）DAB：3.3-二氨基联苯胺（3.3-N-DiaminobenzidineTertrahydrochloride）DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）EIA：马传染性贫血（EquineInfectiousAnaemia）EIAV：马传染性贫血病毒（EquineInfectiousAnaemiaVirus）ELISA：酶联免疫吸附试验（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay）HRP：辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase）OD值：光密度值（OpticalDensity）PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferedSaline）PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）PBMC：外周血单核细胞（PeripheralBloodMononuclearCell)SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SodiumDodecylSulphate-PolyacrylamideGelElectrophoresis)
GB/T17494—2023
5实验室生物安全措施
进行马传染性贫血实验室诊断时.按照GB19489的规定执行.样品采集、保存、运输执行NY/T541的要求。本文件中各类试剂配制用水应符合GB/T6682的要求。6临床诊断
6.1流行特点
6.1.1传染源
患病和带毒动物是EIA主要传染源，发热期的患病动物排毒量最大，隐性动物携带病毒传播具有隐秘性。
6.1.2传播途径
自然条件下，EIAV主要由鹿虹、马蝇、既螯蝇和蚊子等吸血昆虫叮咬和自然交配等方式经血液和黏膜途径传播，也可由污染的手术器械和血液制品等经人工操作传播。EIA多流行于低洼地、潮湿地、沼泽地，吸血昆虫活动活跃期高发，夏季高于其他季节，雨季高于旱季。6.1.3易感动物
自然条件下，EIAV仅感染马、驴、骤等马属动物，马的易感性最强，驴和骠次之，不同品种、年龄和性别的马属动物均可感染。
6.2临床症状
6.2.1潜伏期
自然感染潜伏期一般为20d～40d，人工感染潜伏期平均为10d～30d。6.2.2主要临床症状
病马可见高热、贫血、黄、呼吸道或消化道出血、消瘦、心率加快、四肢和胸腹部下方出现水肿等症状。患马的临床症状表现复杂多样，随病程、环境改变和机体抵抗力的变化而转化。6.2.3临床类型
根据临床症状，通常将EIA患病动物分为急性、亚急性、慢性和隐性4个类型。急性型多见于新疫区或暴发初期·典型特征是高热帮留或至死亡，临床症状明显：亚急性型多见于流行中期·病程比急性型长，典型特征表现为反复发作的间款热，临床症状规律性地随体温的升降而变化：慢性型是最多见的种类型，病程可达数月或数年，其特点与亚急性相似，呈现反复发作的间款热或不规则热·但发热期短，体温上升不高，无热期长，发热期临床症状较亚急性轻微：隐性型无临床可见症状，通常难与健康动物区分，在应激或过劳等某些不良因素下可能转化为有临床症状的类型3结果判定
符合上述流行病学特征和临床症状的病例，判为疑似EIAV感染。确诊应进一步进行实验室诊断。2
样品采集、保存与运输
仪器设备
组织研磨仪。
混匀器。
试剂材料
次性采血针。
一次性采血管(含有肝素抗凝剂）。一次性使用塑料血袋（附带针头，含有肝素抗凝剂，容量250ml）。一次性采血管（不含抗凝剂）。淋巴细胞分离液。
双抗溶液（青霉素G钠盐10kU/ml，硫酸链霉素10mg/mL）。PBS.按照附录A中A.1配制。
1640培养液。
样品采集
全血样品
GB/T17494—2023
核酸检测用全血样品：用一次性采血针于马颈静脉采集马匹血液至5mL一次性采血管中，轻轻水平动采血管.使血液与抗凝剂充分混合病毒培养用全血样品：用一次性使用塑料血袋采集健康马颈静脉血液（全血）150mlL~200ml，轻轻水平晃动采血袋，使血液与抗凝剂充分混合。脾脏组织
无菌采集马新鲜脾脏组织约5cm见方的小块，置于无菌采集袋或其他灭菌容器中，密闭保存。7.3.3血清
用一次性采血针于马颈静脉采集血液至一次性采血管（不含抗凝剂）中，每管采集3mL~5mL。7.4
样品保存和运输
样品采集后，应尽快置于保温箱中，加人预冷的冰袋，密封，宜24h内送实验室检测。待检样品应尽快处理，在4℃存放不超过24h，在一20℃冷冻保存时间稍长。若需长期保存，应放置于一70℃以下条件。尽量避免反复冻融。
7.5样品处理
7.5.1血浆样品处理
全血样品以1000r/min离心5min，取上清液待检3
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2PBMC细胞处理
将新鲜采集的或者保存于4℃～8℃条件下不超过12h的全血样品进行PBMC分离时，可采用两种方法。一种方法是使用淋巴细胞分离液按照说明书进行操作：另一种方法是置于室温（20℃土5℃）垂直自然沉降30min，收集血浆和红细胞之间的白色细胞薄层，立即进行前病毒DNA的提取，或进行PBMC的培养。
脾脏组织样品处理
取待检脾脏组织样品约2g·用组织研磨仪低温破碎后，加人10mL含1%双抗溶液的1640培养液制成组织悬液，充分振荡混勾后，4℃以6000r/min离心5min，取上清液待检7.5.4血清样品处理
血清样品以6000t/min离心5min，取上清液待检。8
实时荧光PCR
仪器设备
实时荧光PCR仪。
分光光度计。
高速台式冷冻离心机。
瞬时离心机。
混匀器。
分光光度计。
试剂材料
商品化细胞基因组DNA提取试剂盒。实时荧光PCR试剂盒（探针法）
透明薄壁PCR管（O.2mL)或八联管。引物和荧光探针，制备过程见附录B阳性对照：T-tat质粒，制备过程见附录C。阴性对照：无核酸酶水。
前病毒DNA提取
待检样品处理按照7.5进行
按商品化细胞基因组DNA提取试剂盒的操作说明书，使用高速台式冷冻离心机提取PBMC中8.3.2
的前病毒DNA，一20℃冰箱中备用。8.4
实时荧光PCR反应
反应体系
将实时荧光PCR试剂盒中的试剂置于冰上融化，取n十2个PCR反应管（n为待检样品、阳性对照4
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和阴性对照数），按表1配制相应反应体系（不同公司生产的RT-PCR试剂盒反应成分不同，体系不同，应根据相应的说明书进行修改使用）·振荡混合均匀后瞬时离心。表1
2X实时荧光PCR缓冲液
上游引物F1(10mol/L）
下游引物R1-3(10pmol/L)
探针PI_re（10μmol/L)
模板DNA
无核酸酶水
总体积
反应程序
实时荧光PCR反应体系
体积/
将加样后的反应管放人实时荧光PCR仅中，记录样本摆放顺序。按下列程序进行反应：98℃预变性15min；95℃变性5s.60℃退火/延伸15$，进行40个循环。8.5
试验成立条件
阴性对照无Ct值，且无特异性扩增曲线阳性对照的Ct值小于5，且有特异性扩增曲线。结果判定
待检样品检测Ct值小于6，且有特异性扩增曲线，判定为EIAV核酸阳性。待检样品检测Ct值大于或等于36、小于或等于40且出现特异性扩增曲线，需重复检测。如重复检测结果Ct值小于36，且有特异性扩增曲线，判定为EIAV核酸阳性。如仍为Ct值大于或等于36、小于或等于40.且出现特异性扩增曲线·判定为EIAV核酸阴性。8.6.2
待检样品检测无Ct值.且无特异性扩增曲线，判定为EIAV核酸阴性。9
病毒分离与鉴定
仪器设备
CO，细胞培养箱。
倒置显微镜。
冷冻离心机。
Ⅱ级生物安全柜。
GB/T17494—2023
试剂材料
新生牛血清。
马血清。
双抗溶液（青霉素G钠盐10kU/mL，硫酸链霉素10mg/mL）。细胞培养瓶（25mL）。
1640细胞培养液。
分离培养
PBMC单层细胞的制备
将分离获得的病毒培养用PBMC进行细胞计数，用含30%新生牛血清、20%马血清、1%双抗溶液的1640细胞培养液制成细胞悬液，按照2×10°/mL接种密度取8mL~10mL接人25mL细胞培养瓶中。37℃、5%CO，培养箱培养24h后，换新鲜培养液继续培养.24h后单层细胞贴壁并生出突起，可用于后续试验。
9.3.2病料接种
一般采用发病马发热期的血浆或病死马的脾脏组织进行分离·待检样品处理按照7.5进行。对于血浆，取5mL直接接种于健康PBMC单层细胞。对于脾脏组织，取3mL组织悬液上清加入单层细胞中，于37℃、5%CO培养箱孵育吸附1h后，再加人含30%新生牛血清、20%马血清、1%双抗溶液的1640细胞培养液制成细胞悬液，继续放置于培养箱进行培养。同时设立健康细胞对照。9.3.3细胞病变观察与鉴定
接种后每日观察细胞病变·连续观察5d～7d。初代分离培养通常难以出现细胞病变，一般需育传2代～3代，甚至更多的代次。如果样品细胞培养物最终出现以细胞变圆、破碎、脱落为特征的细胞病变，提示可能有外源病毒生长。细胞培养物需通过实时荧光PCR进行鉴定，实时荧光PCR阳性的判为EIAV分离阳性。
琼脂凝胶免疫扩散试验
仪器设备
电子天平。
电磁炉及其配套平底锅。
微波炉。
恒温箱。
试剂材料
琼脂（或琼脂糖）。
硼酸溶液（0.145mol/L硼酸.pH8.6）.按照A.2配制。EIAV琼脂凝胶免疫扩散试验抗原（商品化试剂）：系EIAVp26重组蛋白纯化产物冻干粉，简称EIAV抗原。
阳性对照血清（商品化试剂）。阴性对照血清（商品化试剂）。PBS，按照A.1配制
玻璃锥形瓶。
平Ⅲ（直径90mm）。
10.2.9六角打孔器（孔径4.5mm，孔间距4.5mm）。10.2.10
湿盒。
棉纱手套。
平板的制备
琼脂液配制
GB/T17494—2023
称取琼脂（糖）1g于玻璃锥形瓶中，加人100mL硼酸溶液，配制成1%琼脂液。10.3.2溶解
将琼脂液（10.3.1）置于微波炉中加热至刚刚沸腾，中间佩戴棉纱手套取出玻璃锥形瓶轻轻摇晃混匀数次，如此反复加热至少3次，直至琼脂完全融化，注意不要沸腾过度造成水分蒸发10.3.3制板
取直径90mm的平血放在水平台面上，每皿加人热溶化琼脂液25mL，加盖室温冷却凝固至少3h，凝固后倒置平皿，防止水分蒸发。10.3.4打孔
用六角打孔器直接在凝固的琼脂上进行打孔，现用现打，并用针头小心挑出孔内的琼脂。10.3.5封底
挑出孔中琼脂后，将一电磁炉专用平底锅盛水后置于电磁炉上，加热至沸腾后，立即关闭电源，将琼脂平板置于水面上放置2min，取出后擦干平板外底部水分，即完成封底。10.4操作方法
10.4.1加样
将EIAV抗原（冻干粉）瓶中加人2mLPBS溶解后，取30μL加于中央孔：外周孔按顺时针方向依次标记为1~6.加样时，取阳性对照血清30L加于第1孔、第3孔、第5孔，第2孔、第4孔、第6孔加入待检血清样品或者阴性对照血清。10.4.2反应
将平板放于湿盒中，置于37℃避光恒温箱内，逐日观察，连续观察3d并记录结果10.5试验成立条件
当抗原孔与阳性对照血清孔之间出现1条清晰的沉淀线，与阴性对照血清孔之间无沉淀线出现时，试验成立。
10.6结果判定
10.6.1阳性
抗原孔与待检血清孔之间出现1条清晰的沉淀线，且与阳性对照的沉淀线相吻合者（见图1的孔
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