本文件描述了猪繁殖与呼吸综合征（PRRS)的临床诊断和实验室诊断的方法。本文件适用于猪繁殖与呼吸综合征的诊断和监测。临床诊断方法适用于PRRS临床疑似病例的诊断，病毒分离与鉴定、反转录聚合酶链反应（RTPCR)和实时反转录聚合酶链反应（Realtime RTPCR)适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)的检测，免疫过氧化物酶单层试验（IPMA)、间接免疫荧光试验（IFA)和间接酶联免疫吸附试验（ELISA)适用于PRRSV抗体的检测以及感染状况的监测。

ICS11.220
CCS B 41
中华人民共和国国家标准
GB/T18090—2023
代替GB/T18090—2008
猪繁殖与呼吸综合征诊断方法
Diagnostic techniques for porcine reproductive and respiratory syndrome2023-03-17发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2023-10-01实施
规范性引用文件
术语和定义
缩略语
生物安全措施
临床诊断
易感动物
临床症状
病理变化
结果判定
实验室检测样本采集与保存
采样器材
7.2样本采集
样本保存
8病毒的分离与鉴定
主要器材、试剂与细胞
样本制备
试验方法
结果判定
反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）9
主要器材
主要试剂
样本制备
试验方法
结果判定
10实时反转录-聚合酶链反应（实时RT-PCR）10.1
主要器材
主要试剂
样本制备·
试验方法
结果判定
11免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）次
GB/T18090—2023
GB/T18090—2023
主要器材
主要试剂
试验方法
结果判定
12间接免疫荧光试验（IFA）
主要器材
主要试剂
试验方法
结果判定
13间接酶联免疫吸附试验（间接ELISA）13.1
主要器材
主要试剂
试验方法
结果判定
14综合判定
附录A（规范性）
附录B（规范性）
猪肺泡巨噬细胞（PAMs）制备、鉴定、保存试剂的配制
附录C（资料性）RT-PCR、定量RT-PCR引物探针和特异性扩增片段序列10
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则起草。
GB/T18090—2023
第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定本文件代替GB/T18090—2008《猪繁殖与呼吸综合征诊断方法》，与GB/T18090—2008相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下：更改了临床诊断（见第6章，2008年版的第4章）；增加了实时反转录聚合酶链反应（见第10章）。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出。本文件由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本文件起草单位：中华人民共和国大连海关、中国农业大学、中华人民共和国郑州海关。本文件主要起草人：胡传伟、杨汶春、肇慧君、周磊、张雪、刘钊、苗丽、贾赞、李叶。本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：-2000年首次发布为GB/T18090一2000，2008年第一次修订；一本次为第二次修订。
1范围
猪繁殖与呼吸综合征诊断方法
本文件描述了猪繁殖与呼吸综合征（PRRS)的临床诊断和实验室诊断的方法GB/T18090—2023
本文件适用于猪繁殖与呼吸综合征的诊断和监测。临床诊断方法适用于PRRS临床疑似病例的诊断，病毒分离与鉴定、反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和实时反转录-聚合酶链反应（Real-timeRT-PCR)适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)的检测，免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）、间接免疫荧光试验（IFA)和间接酶联免疫吸附试验（ELISA)适用于PRRSV抗体的检测以及感染状况的监测。规范性引用文件下载标准就来标准下载网
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682
分析实验室用水规格和试验方法GB19489
实验室生物安全通用要求
NY/T541
3术语和定义
兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
AEC：氨乙基咔唑（3-amino-9-ethyl-carbazole）bp：碱基对（basepair）
CPE：致细胞病变作用（cytopathic effect）DEPC：焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）EB：溴化乙锭（ethidiumbromide）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid）ELISA：酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbentassay）FITC：异硫氢酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate）HRP：辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase）IFA：间接免疫荧光试验（indirectimmunofluorescentassay）IPMA：免疫过氧化物酶单层试验（immunoperoxidasemonolayerassay）OD：光密度（opticaldensity）PBS：磷酸盐缓冲盐水（phosphatebuffered saline）1
GB/T 18090—2023
PRRS：猪繁殖与呼吸综合征（porcinereproductiveand respiratory syndrome)PRRSV：猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus）Real timeRT-PCR：实时反转录聚合酶链反应（Real time reverse transcription-polymerase chainreaction）
RNA：核糖核酸（ribonucleic acid）RT-PCR：反转录聚合酶链反应（reversetranscription-polymerasechainreaction）SDS：十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）TMB：四甲基联苯胺（3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine）5生物安全措施
PRRSV的分离与鉴定应在生物安全二级（BSL-2)实验室进行，按照GB19489执行。6临床诊断
6.1易感动物
家猪是PRRSV的易感动物，各种年龄和品种的猪均易感，主要危害妊娠母猪和仔猪。PRRSV也可感染野猪。
6.2临床症状
6.2.1急性型：妊娠母猪以繁殖障碍为主，表现为晚期流产、早产、产死胎、木乃伊胎和弱仔，死亡率一般为1%～4%。哺乳仔猪表现为体温升高、精神萎靡、食欲废绝、嗜睡、扎堆、消瘦、呼吸困难和结膜水肿等，断奶前的死亡率可达60%。保育猪、生长育肥猪食欲下降、精神沉郁、耳发、呼吸困难、咳嗽、被毛粗乱、平均日增重降低，死亡率可达12%～20%。如果继发或并发其他疾病，可致死亡率升高。公猪表现出食欲下降、精神沉郁、呼吸道症状、精液质量下降等。6.2.2慢性型：妊娠母猪散发性流产、胎儿异常、不规律返情、空怀等，产活仔率下降。仔猪和生长育肥猪有不同程度的呼吸系统症状，猪只生长迟缓，如有细菌性继发感染，生长猪的死淘率可达5%～20%。持续性感染和亚临床感染猪无明显临床表现6.2.3非典型：以高热、高发病率和死亡率为特征。妊娠母猪的流产率为40%～100%，死亡率可达10%以上，哺乳仔猪的死亡率可高达100%，保育猪的死亡率可达50%以上。6.3病理变化
6.3.1剖检病理变化：感染猪肺脏轻度或中度水肿，呈橡胶样，大部分淋巴结肿大。高致病性PRRSV毒株感染猪的皮肤出血，肺脏严重水肿和实变。继发细菌感染的病例可出现胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎等。
6.3.2组织病理学变化：肺脏呈典型的间质性肺炎，肺泡间隔增厚、单核细胞与淋巴细胞浸润以及Ⅱ型肺泡上皮细胞增生，具有诊断意义。淋巴结生发中心变大、增生、坏死，淋巴窦内有多核巨细胞浸润，6.4结果判定
6.4.1出现上述临床症状和病理变化，可初步判定为疑似PRRS。6.4.2确诊应按照NY/T541规定的要求采集猪的全血、血清及肺脏、脾脏、淋巴结等组织样本，进行实验室检测。
7实验室检测样本采集与保存
7.1采样器材
GB/T18090—2023
解剖刀、剪刀、镊子、注射器（5mL、10mL）及针头、扁桃体采样器、真空采血管（含EDTA抗凝剂）、棉绳、离心机、离心管（2mL、10mL）、样本保存管、工作服、一次性手套、采样记录单、记号笔、防水标签、封口膜、冰袋等。
7.2样本采集
7.2.1血液样本
用注射器无菌采集发病猪或感染猪血液，凝固后分离血清，或采集抗凝血，经离心分离出血浆。血清、抗凝血或血浆可用于PRRSV的分离与鉴定、RT-PCR和Real timeRT-PCR检测。血清可用于PRRSV抗体检测，猪群PRRSV抗体的监测应采集至少30头猪的血清样本。7.2.2组织样本
无菌采集病死猪或扑杀猪的肺脏、脾脏、淋巴结、扁桃体等组织，用于PRRSV的分离与鉴定、RTPCR和Real timeRT-PCR检测。
7.2.3其他样本
公猪的精液可用于PRRSV的RT-PCR和RealtimeRT-PCR检测。将绵绳悬挂于猪栏，让猪咬绵绳，挤压绵绳收集口腔液，可用于PRRSV的RT-PCR和RealtimeRT-PCR检测以及抗体检测。7.3样本保存
采集的样本应保存于4℃，用于病毒分离的样本应在24h～48h内运送至实验室。不能立即进行检测的样本应保存于一20℃冰箱，长期保存应置于一70℃冰箱。8病毒的分离与鉴定
8.1主要器材、试剂与细胞
主要器材
二氧化碳培养箱（37℃）。
冰箱（4℃、-20℃、70℃）。
倒置生物显微镜，
恒温水浴箱（37℃）。
离心机及离心管（规格10mL）。96孔微量细胞培养板。
微量可调移液器（规格100μL～1000μL、20μL～200μL、1μL～20μL）。组织研磨器。
微孔滤器（滤膜孔径0.22μm）。3
GB/T18090—2023
8.1.2主要试剂
8.1.2.1细胞生长液与维持液，按照附录A中A.1.1配制。8.1.2.2PRRSV阳性血清或单克隆抗体。8.1.3细胞
猪原代肺泡巨噬细胞（PAMs)或MARC-145细胞。PAMs按照附录A进行制备、保存与复苏。应首选PAMs进行PRRSV分离。
8.2样本制备
血清、全血或血浆样本可直接用于病毒分离。组织样本经剪碎后经组织研磨器研磨，按照1：9的比例加人RPMI1640培养基制成10%的组织悬液，经3000r/min离心15min后，吸取上清液，加入青霉素（500IU/mL）、链霉素（500μg/mL）、庆大霉素（500μg/mL）和两性霉素B（200μg/mL）。有细菌污染的样本应用微孔滤器进行过滤处理。8.3试验方法
8.3.1单层细胞制备
用RPMI1640细胞生长液稀释复苏的PAMs，细胞终浓度为每毫升1×106个/mL细胞，或用DMEM细胞生长液稀释MARC-145细胞，细胞终浓度为每毫升5X104个细胞。然后，将稀释的细胞加人96孔细胞培养板中，100μL/孔，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养长成单层。8.3.2样本稀释
在空白的96孔细胞培养板中加人细胞培养液RPMI1640，90μL/孔，在A排和E排各孔内分别加入7.2.1制备的样本，10μL/孔（样本1：10稀释，重复2孔），摇动培养板后，从A排和E排孔各取10uL分别移入B排和F排孔内（样本1：100稀释）。摇动培养板后，再从B排和F排孔各取10uL分别移入C排和G排孔内（样本1：1000稀释）。同样，再从从C排和G排孔各取10μL分别移人D排和H排孔内（样本1：10000稀释）。每个培养板应设置不接种样本的细胞空白对照。一般而言，对用于PRRSV分离的样本进行1：10和1：100稀释即可。8.3.3样本接种
吸取按8.3.2方法稀释的样本50L接种于8.3.1中对应的细胞孔（第1代）中，吸附1h后，加入细胞维持液，100uL/孔，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养，每天观察细胞病变，连续观察2d～5d，8.3.4培养物盲传
样本初次接种细胞培养2d后，不论有无CPE，应将每孔内细胞液取25uL，移人按照8.3.1制备的新细胞板对应的孔内（第2代），置于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养2d～5d，每天观察CPE。样本的细胞培养物应盲传2代～3代，8.3.5病毒鉴定
用PRRSV阳性血清或单克隆抗体，采用本文件的免疫过氧化物酶单层试验（IPMA)或间接免疫荧光试验（IFA），对出现细胞病变的培养物进行PRRSV的鉴定4
8.4结果判定
GB/T18090—2023
8.4.1PRRSV感染细胞的CPE主要表现为细胞圆缩、聚集、固缩，最后崩解脱落。初次接种样本和盲传后均出现CPE，或盲传后出现CPE，并经IPMA或IFA检测为阳性，判定为PRRSV分离阳性，8.4.2初次接种样本和盲传后均无CPE，或出现CPE但经IPMA或IFA检测为阴性，判为PRRSV分离阴性。
9反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）9.1主要器材
PCR仪。
高速台式冷冻离心机（4℃，离心速度12000r/min以上）。9.1.3
稳压稳流电泳仪和水平电泳槽。9.1.4
凝胶成像系统。
混匀器。
冰箱（2℃～8℃、一20℃和-70℃）。9.1.7
微量可调移液器（规格100uL～1000uL、20uL～200uL、1uL～20uL）以及无RNase污染带滤芯吸头，
组织研磨器。
9.2主要试剂
除特别说明以外，本文件所用试剂均为分析纯，所用水应符合GB/T6682中一级水的规格，所有试剂均用无RNase污染的容器分装2PBS液，按照附录B中B.1配制
商品化的RNA提取裂解液。
三氯甲烷。
异丙醇（一20℃预冷）。
DEPC水：在100mL三蒸水中加人100μLDEPC，18℃～22℃室温下过夜，121℃灭菌15min。也可用商品化的产品。
75%乙醇：75mL无水乙醇加25mLDEPC水，配制成75%乙醇溶液，一20℃预冷备用。M-MLV反转录酶（10U/μL）。
5×RT缓冲液
RNA酶抑制剂（40 U/μL）。
Taq 酶(10 U/μL)。
10×PCR缓冲液。
dNTPs（含dATP、dTTP、dCTP、dGTP，各1ommol/L）。9.2.14
10XMgClz（25mmol/L)。
甘油或矿物油。
9.2.16引物，检测PRRSV的引物对序列见附录C,加DEPC水配制成100umol/L的储存浓度和20μmol/L的工作浓度。
9.2.175×TBE电泳缓冲液，按照B.2配制。5
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。