本文件描述了马铃薯斑纹病菌的检疫鉴定方法。 本文件适用于茄科和伞形科等植物的种子、种苗、块茎、块根等植物材料以及传播介体木虱中马铃薯斑纹病菌的检疫鉴定。

ICS65.020.20
CCSB16
中华人民共和国国家标准
GB/T43169—2023
马铃薯斑纹病菌检疫鉴定方法
Detection and identification of Candidatus Liberibacter solanacearum2023-09-07发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2024-04-01实施
GB/T43169-2023
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1范围
马铃薯斑纹病菌检疫鉴定方法
本文件描述了马铃薯斑纹病菌的检疫鉴定方法。GB/T43169-—2023
本文件适用于茄科和伞形科等植物的种子、种苗、块茎、块根等植物材料以及传播介体木虱中马铃薯斑纹病菌的检疫鉴定。
规范性引用文件
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GB/T6682
术语和定义
分析实验室用水规格和试验方法本文件没有需要界定的术语和定义。4马铃薯斑纹病菌基本信息
中文名称：马铃薯斑纹病菌
拉丁学名：CandidatusLiberibactersolanacearumLieftingetal.，2oo9英文名称：zebrachipdisease，zebracomplex中文异名：斑马片病、马铃薯斑纹片病菌同物异名：CandidatusLiberibacterpsyllaurousHansenetal.，2008分类地位：原核生物界（KingdomMonera），变形菌门（Proteobacteria）·a-变形菌纲（Alphapro-teobacteria），根瘤菌目（Rhizobiales），叶杆菌科（Phyllobacteriaceae），韧皮部杆菌属（CandidatusLiberibacter)。
马铃薯斑纹病菌其他信息见附录A。方法原理
马铃薯斑纹病菌目前还无法培养，因此方法原理为采用马铃薯斑纹病菌特异性引物或探针，通过普通聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）、巢式PCR或实时荧光PCR方法进行检测。6
仪器设备和主要试剂
仪器设备
实时荧光PCR仪
支持寡核苷酸探针（TagMan）双标记水解探针，温度控制范围为30℃～100℃。1wwW.bzxz.Net
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PCR仪
温度控制范围为4℃~99℃。
核酸分析仪
波长为230nm~260nm。
6.1.4超净工作台
洁净等级100级，过滤效率达到99.99%。6.1.5电泳仪
电压10V~300V，最小可调1V：电流4mA~400mA，最小可调1mA6.1.6
凝胶成像分析仪
紫外透射波长为302nm。
研磨机
转速为50r/min600r/min。
台式小型离心机
转速≥12000r/min。
6.1.9旋涡振荡器
转速为200r/min~3.000r/min。
微量进样器
量程为0.2μL2.5μL、1.0μL~10μL10μL~100L、100L~1000μ6.1.11
电子天平
精确度为0.001g。
水浴锅
温度控制范围为室温至100℃。
纯水仪
制备出的纯水水质应符合GB/T6682中一级水的规格4高压灭菌器
最高工作温度不低于121℃。
主要试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯。磷酸缓冲盐溶液（phosphatebufferedsaline，PBS）、液氢，聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-10o）、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷酸三磷酸（dNTPs）、脱氧核糖核酸（de2
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oxyribonucleicacid.DNA）聚合酶、引物和探针、琼脂糖、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇、双重去离子水(doubledistilledwater,ddH,O)。7病菌的鉴定
7.1症状检查
该病菌在不同寄主甚至同一寄主不同品种上的为害症状及为害程度均有差异。马铃薯、番茄可检查植株地上部分，主要表现为叶片黄化矮化、叶脉变色、全株叶片向上卷曲、叶片焦枯、腋芽增生、节间缩短肿大、气生块签、果实畸形发育停滞：此外，马铃薯还可检查植株地下部分·症状表现为甸签倒伏、维管束组织变褐、内部组织产生髓质射线，该症状通常在块茎切片或切块油炸后表现较为明显，即薯片或薯条出现黑斑或斑纹胡萝下，芹菜可检查植株地上和地下部分，地上部分的症状表现为叶片卷曲黄化、叶片增生；地下部分症状表现为根变形、发育不良以及次生根增殖。具体症状图片见附录B。样品采集与制备
7.2.1植株样品制备
采集样品时要同时采集有症状和无症状的叶片和/或茎，从有症状的植物上取3片一5片植物叶片和/或签，无症状植物上不同部位取5片～10片叶子（包括新生叶片）和/或。植物地下部分如马铃薯块茎，胡萝下根等都能够用来检测马铃薯斑纹病菌，选取症状明显的组织进行检测。在进行提取之前，要对材料进行二次取样，以保证材料包含较多的维管束组织，例如：叶柄、叶中脉、形成层或马铃薯块茎维管束环。植物样品用研磨仪或液氮进行研磨处理。7.2.2种子样品制备
种子样品可任选以下两种方法之一进行制备处理：取种子样品1g~2g（例如：胡萝卜种子约450粒~900粒）直接用研钵研磨，或用研磨机研磨，或置塑料袋内用锤子粉碎后取适量粉碎样品提取核酸；取种子样品1g~2g（例如：胡萝卜种子约450粒~900粒）加入50mL~100mLPBS缓冲液4℃冰箱浸泡过夜·弃缓冲液，浸泡后的种子用研磨仪研磨，研磨后加20mLPBS缓冲液振荡混匀，然后用纱布或滤纸过滤，滤液12000r/min离心后取沉淀物提取核酸另外，如果是种衣剂处理过的种子应先去除种衣，按照每克种子加人10mL~50mL0.5%TritonX-100的比例振荡洗涤30min，洗3次后在水中过夜软化，再任选上述两种方法之一进行制备处理。7.2.3木虱样品制备
从有症状或无症状的植物中收集成虫木虱，置于研钵中加人液氮研磨备用。7.3核酸提取
根据常规的十六烷基三甲基漠化铵法（Cetyltrimethylammoniumbromide，CTAB）或商业化核酸提取试剂盒规定的质量，取植物组织、术虱样品研磨粉未状物质或种子浸泡液的沉淀物提取待测样品核酸，且应根据不同提取物（植物、昆虫）选择合适的商业化核酸提取试剂盒。7.4检测
选用普通PCR、巢式PCR、实时荧光PCR检测方法中的任意一种，检测具体操作步骤按照附录C、附录D和附录E的规定。
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结果判定
选用普通PCR、巢式PCR、实时荧光PCR检测方法中任意一种的检测结果为阳性，可判定检出马铃薯斑纹病菌。
样品保存
植物组织样品置于密封样品袋保存于4℃冰箱中，木虱样品保存于70%乙醇中，以备复核。阳性样品保存期满后应经高压灭菌后方再处理。10
结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、接收时间、实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。对检出马铃薯斑纹病菌的样品应保存于4℃冰箱中，以备复核。普通PCR和巢式PCR琼脂糖凝胶电泳检测电泳结果图片、荧光PCR检测原始数据等资料应妥善保存4
A.1症状特征
附录A
（资料性）
马铃薯斑纹病菌相关信息
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马铃薯斑纹病菌危害寄主植物的叶片、枝干、块茎等部位，在不同寄主上的症状存在一定的差异马铃薯、番茄等茄科植物的地上部分的症状与植原体的危害症状类似，表现为叶片黄化矮化、叶脉变色、全株叶片向上卷曲、叶片焦枯、腋芽增生、节间缩短肿大、气生块茎、果实畸形发育停滞：马铃薯的地下部分症状表现为葡高倒伏，维管束组织变褐、内部组织产生髓质射线该症状通常在块签切片或切块油炸后表现较为明显，即薯片或薯条出现黑斑或斑纹。胡萝卜、芹菜等伞形科植物的地上部分的症状与植原体的危害症状类似，表现为叶片卷曲黄化、叶片增生：地下部分症状表现为根变形、发育不良以及次生根增殖。A.2寄主范围
马铃薯斑纹病菌已知寄主主要有茄科和伞形科植物，茄科包括：马铃薯（Solanumtuberosum），番茄（S，lycopersicum），茄子（S.melongena），树番茄（S.betaceum），银叶茄（S.elaeagnifolium），东方龙葵（S.ptyeanthum），辣椒（Capsicumannuum），烟草（Nicotianatabacum），灯笼果（Physalisperuviana），和枸杞（Lycium barbarum）等。伞形科包括：胡萝卜（Daucus carota），芹菜（Apiumgraveolens），简香（Foeniculumvulgare），芜要（Petroselinumcrispum），欧防风（Pastinacasativa），香芹（Libanotisseseloides）和欧洲萝卜（Pastinaca sativa）等。夢科、旋花科和荨麻科也是其寄主。马铃薯斑纹病菌潜在的寄主范围比已知的寄主范围更广泛。A.3分布
目前已报道马铃薯斑纹病菌分布的国家或地区如下：非洲：摩洛哥、突尼斯；
北美洲：加拿大、厄瓜多尔、萨尔瓦多、危地马拉、洪都拉斯、墨西哥、尼加拉瓜、美国：亚洲：以色列：
欧洲：奥地利、比利时、爱沙尼亚、芬兰、德国、希腊、意大利、挪威、葡萄牙、西班牙、瑞典、英国、加那利群岛：
大洋洲：新西兰、诺福克岛。
A.4传播途径
马铃薯斑纹病菌可通过带菌薯块和种子等紧殖材料进行远距离传播：由间通过昆虫介体传播。此外，病菌还可通过嫁接、染病植株、带菌种子和马铃薯种薯等进行传播和扩散日前报道的传播介体包括：马铃薯木虱（Bactericeracockerelli）、B.trigonica、B.maculipennis和胡萝卜木虱(Triozaapicalis）等。A.5单倍型
马铃薯斑纹病菌目前已知的单倍型有10种（见表A.1），不同单倍型之间具有不同的地理范围和植物宿主，且与木虱的种类和取食行为密切相关5
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单倍型
H(Con)
马铃薯、番茄
马铃薯、番茄
马铃薯斑纹病菌10种单倍型的信息分布地区
中美洲：洪都拉斯、危地马拉
北美洲：墨西哥、美国（亚利桑那州、加利福尼亚州、俄勒冈州、华盛顿州、爱达荷州）大洋洲，新西兰
北美洲：西哥、美国
胡萝卜、芹菜、苗香、
芜蔓等
胡萝卜、芹菜、葡香、
芜菱等
马铃薯、香葡、胡萝
卜、芹菜、茴香、芜
马铃薯
马铃薯
伞形花科：萝科
旋花科
欧洲：芬兰、瑞典、挪威、德国、奥地利亚洲：以色列
欧洲：比利时、西班牙、法国、希腊、葡萄牙捷克、意大利、加那利群岛
非洲：突尼斯、摩洛哥
亚洲：以色列、日本
欧洲：比利时、西班牙、法国、希腊、葡葡牙、加那利群岛
非洲：突尼斯、摩洛哥
北美洲：美国
北美洲：美国
欧洲·芬兰
北美洲·美国
北美洲：墨西哥
欧洲：芬兰、德国
传插媒介
马铃薯木虱Baclericera cock
erelli)
马铃薯木虱（Bactericeracock
erelli),B.maculipennis
胡萝卜木虱（Triozaapicalis）Bactericera trigonica
马铃薯木虱（Bactericera cockerelli),B.trigonica
马铃薯木虱（Bactericerucock-erelli)
马铃薯木虱（Bactericerucock
erelli)
尊麻木虱（Trioza urticae）
附录B
（资料性）
马铃薯斑纹病菌危害症状
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马铃薯斑纹病菌危害马铃薯、茄、胡萝卜、芹菜的症状分别见图B.1、图B.2、图B.3、图B.4。a)
马铃薯斑纹病菌危害马铃薯叶片的症状e）马铃薯斑纹病菌危害马铃薯块茎的症状马铃薯斑纹病菌危害马铃薯块茎切片油炸后的症状
马铃薯斑纹病菌危害马铃薯叶片的症状b)
d马铃薯斑纹病菌危害马铃蕾块茎的症状马铃薯斑纹病菌危害马铃薯块茎切条f
油炸后的症状
马铃薯斑纹病菌危害马铃薯的症状GB/T43169—2023
a)马铃薯斑纹病菌危害番茄的田间症状图B.2
b）马铃薯斑纹病菌危害番茄出现的叶片黄化、卷曲症状马铃薯斑纹病菌危害番茄的症状注：左为马铃薯斑纹病菌危害胡萝下叶片出现卷叶和紫化的症状：中为马铃薯斑纹病菌危害胡萝下叶片仅出现卷叶的症状：右为正常的胡萝下，图B.3马铃薯斑纹病菌危害胡萝卜的症状a)马铃薯斑纹病菌危害芹菜的切面症状b）马铃薯斑纹病菌危害芹菜出现的叶片增生症状图B.4马铃薯斑纹病菌危害芹菜的症状8
普通PCR扩增
引物序列
（规范性）
马铃薯斑纹病菌普通PCR检测程序普通PCR检测的引物序列见表C.1。表C.1
引物名称
LsOTX16/23F
LsoTX16/23R
反应体系及反应条件
普通PCR检测的引物序列
引物序列
上游引物：5'-atagcaagttetaggg-3下游引物，5-ggtacetcccatatcge-3GB/T43169—2023
PCR产物大小/bp
普通PCR反应体系见表C.2。
反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃40，40个循环：72℃5min（当使用不同仪器和试剂时，可根据要求将反应参数进行适当调整）。预期扩增产物为383bp.
上述反应中均需同时设置阳性对照（马铃薯斑纹病菌）、阴性对照（健康马铃薯叶片）和空白对照（以灭菌蒸馏水代替模板DNA)。
10XPCR缓冲液
50mmol/L氯化镁
10mmol/LdNTPs
10μmol/L引物LsoTX16/23F
10μmol/L引物LsoTX16/23R
5U/LTaqDNA聚合酯
10ng/μL~100ng/μL模板DNA
反应体系
加样量
补至25
注：反应体系中各试剂的量使用等效的PCR预混液时，具体情况根据采用的试剂进行适当调整C.2
琼脂糖凝胶电泳
制备1.5%的琼脂糖凝胶，按比例均匀电泳上样缓冲液和PCR扩增产物，用DNA分子标记（Marker）作为分子质量标记，进行电泳分析.电泳结束后在凝胶成像仪的紫外投射光下观察是否扩增GB/T43169-2023
出预期的特异性DNA条带，并拍摄记录。.3
质量控制
阳性对照应出现383bp的预期扩增片段，阴性对照和空白对照应都未出现383bp的预期扩增片段。上述指标如有一项不符合者，应重新进行普通PCR扩增。C.4结果判定
检测样品如出现383bp的预期扩增片段判为阳性，如未出现383bp的预期扩增片段判为阴性。10
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