本标准适用于以微生物发酵生成含钴胺素的发酵液，经转化和结晶得到的食品营养强化剂氰钴胺。

中华人民共和国国家标准
GB1903.43-2020
食品安全国家标准
食品营养强化剂bzxz.net
2020-09-11发布
氰钴胺
2021-03-11实施
中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局
1范围
食品安全国家标准
食品营养强化剂
氰钴胺
GB1903.43—2020
本标准适用于以微生物发酵生成含钻胺素的发酵液，经转化和结晶得到的食品营养强化剂氰钻胺。2
分子式、结构式和相对分子质量分子式
CHssCoNOuP
结构式
2.3相对分子质量
氰钻胺：1355.38（按2018年国际相对原子质量）技术要求
感官要求
感官要求应符合表1的规定。
理化指标
暗红色
结晶状颗粒或粉末
理化指标应符合表2的规定。
氰钴胺含量(以干基计)，/%
干燥减量+te/%
有关物质，20/%
丙酮/%
铅（Pb）/（mg/kg）
总碑（以As计）/（mg/kg）
感官要求
检验方法
GB1903.43—2020
取适量试样置于清洁、干燥的白瓷盘中，在自然光线下，观察其色泽和状态
理化指标
96.0~102.0
检验方法
附录A.4
附录A.5
附录A.6
附录 A.7
GB5009.75或GB5009.12
GB5009.76或GB5009.11
注：商品化的氰钴胺（维生素B：）产品应以符合本标准的氰钴胺为原料，添加工艺所必需的食品原料和/或食品添加剂作为辅料，其质量、范围和使用量应符合相应的食品安全国家标准的规定，2
A.1警示
附录A
检验方法
GB1903.43—2020
本标准的检验方法中使用的部分试剂具有毒性或者腐蚀性，操作时应采取适当的安全和防护措施。A.2
一般规定
本标准除另有规定外，所用试剂的纯度应为分析纯·所用标准滴定溶液、杂质测定用标准溶液、制剂及制品，应按GB/T601、GB/T602、GB/T603的规定制备，实验用水应符合GB/T6682中三级水的规定。试验中所用溶液在未注明用何种溶剂配制时，均指水溶液A.3
鉴别试验
试剂和材料
丙酮。
三氯甲烷。
乙醚。
盐酸。
乙酸钠。
溴化钾。
氟化钠。
硫酸氢钾。
次磷酸。
酚酞指示剂。
乙酸（1mol/L）。
氢氧化钠溶液（100g/L）：称取10g氢氧化钠，加水溶解并定容至100mL。氢氧化钠溶液（20g/L)：称取1g氢氧化钠.加水溶解并定容至50mL。1-亚硝基-2-茶酚-3,6-二磺酸钠溶液（2g/L）：称取0.1g1-亚硝基-2-萘酚-36-二磺酸钠，缓缓加水溶解并定容至50mL。
硫酸溶液（1十7）：取70mL水，缓缓注入10mL硫酸，混匀硫酸亚铁铵饱和溶液：称取42g六水合硫酸亚铁铵，加水溶解并定容至100mL。仪器和设备
天平：感量0.0001g
埔埚。
蒸馏装置。
紫外可见分光光度计。
红外光谱仪。
A.3.3鉴别方法
A.3.3.1溶解性
略溶于水和乙醇，不溶于丙酮、三氯甲烷或乙醚。A.3.3.2紫外鉴别
GB1903.43—2020
准确称取30mg试样于1000mL容量瓶中，用水定容至刻度，采用紫外-可见分光光度计测定，在吸收谱上应出现最大峰278nm土1nm，361nm士1nm和550nm士2nm。361nm波长处的吸光度与278nm波长处的吸光度的比值应为1.70~1.90。361nm波长处的吸光度与550nm波长处的吸光度的比值应为3.15~3.40。
A.3.3.3钻原子鉴别
取约1mg试样，加硫酸氢钾约50mg，置中，灼烧至熔融，放冷，用玻璃棒捣碎，加3mL水，煮沸使溶解，加酚酞指示剂1滴，混匀，滴加氢氧化钠溶液（A.3.1.12）至显淡红色后，加500mg乙酸钠、0.5mL乙酸和0.5mL1-亚硝基-2-萘酚-3.6-二磺酸钠溶液，立即显现红色或橙红色，加盐酸0.5mL.煮沸1min，颜色应不消失。
A.3.3.4氰离子鉴别
移取约5mg氰胺试样手盛有5mL水的50mL蒸馏烧瓶中，蒸留烧瓶连接一个短的、水冷却的垂直冷凝装置，冷凝装置出口端浸人到盛有1mL氢氧化钠溶液（A.3.1.13）的测试管中。样品溶解于蒸留烧瓶中后，加入2.5mL次磷酸·连接好冷就装置，缓慢加热煮沸10min，收集1mL蒸馅液于测试管中。测试管中加人4滴冷的、硫酸亚铁铵饱和溶液，轻摇，加人30mg氟化钠加热至沸腾，立即加人几滴硫酸溶液至溶液变澄清，再加入3滴～5滴硫酸溶液，数分钟内溶液变成蓝色至蓝绿色。A.3.3.5红外鉴别
将溴化钾压片试样的谱图与氰钻胺标准品的红外光谱图（见附录B中图B.1）比较，两者应基本一致。
A.4氰钴胺含量
仪器和设备
A.4.1.1天平：感量0.0001g
A.4.1.2紫外分光光度计。
A.4.2分析步骤
精确称取约0.025g（精确至0.0001g）干燥试样于1000mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀得到试样溶液。用紫外可见分光光度计测定。以水作空白，采用1cm比色血在361nm处测定试样溶液吸光度值。
A.4.3结果计算
氰钻胺含量（以干基计)的质量分数w1按式(A.1)计算，以%表示。AV
wi=207×m
×100%
.(A.1)
式中：
氰钻胺紫外吸光值：
氰钻胺的标准百分吸收系数（E）；V
试样定容的体积，单位为毫升（mL）：试样的质量（以干基计），单位为克（g）。实验结果以平行测定结果的算术平均值为准，保留一位小数。GB1903.43-—2020
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于算术平均值的2.0%。A.5
干燥减量
A.5.1方法原理
干燥减量是指试样在105℃2℃温度下干燥后失去水分及其他挥发性物质的质量与试样质量之比，用百分数表示。
仪器和设备
天平：感量0.0001g。
称量瓶。
真空干燥箱。
分析步骤
称取50mg（精确至0.0001g）试样，置于已干燥恒重（105℃士2℃，30min）的称量瓶中。将试样在称量瓶中均匀铺开。在105℃土2℃、真空压力低于2.67kPa条件下干燥至恒重。将称量瓶置于干燥器中冷却至室温，称量。
A.5.4结果计算
试样干燥减量的质量分数2，按式（A.2）计算，以%表示ml-m=×100%
式中：
千燥前带有样品的称量瓶的质量，单位为克（g）；m
m—干燥后带有样品的称量瓶的质量，单位为克（g)；m。干燥后称量瓶的质量，单位为克（g）。计算结果保留2位有效数字。
....(A.2)
取平行测定结果的算术平均值为测定结果，两次平行测定结果的绝对差值不大于1.0%。有关物质
方法原理
试样用流动相溶解后，采用液相色谱仪检测，峰面积比较法定量。A.6.2
试剂和材料
A.6.2.1氯胺T。
A.6.2.2甲醇。
磷酸氢二钠。
A.6.2.4磷酸。
A.6.2.5盐酸。
GB1903.43—2020
磷酸氢二钠溶液：0.028mol/L。称取10.03g十二水合磷酸氢二钠，加水溶解并定容至1000ml。
盐酸溶液：0.05mol/L。取4.5mlL盐酸，加水至1000ml，混匀。A.6.2.8
氯胺T溶液：0.1%。量取0.1g氯胺T，加水溶解并定容至100mL。仪器和设备
天平：感量0.0001g。
高效液相色谱仪：配有紫外检测器。分析步骤
试样溶液：称取试样10mg于10mL容量瓶中，用流动相溶解并定容至刻度，混匀。A.6.4.2
对照溶液：精密量取1mL试样溶液于100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，混匀。系统适用性溶液：称取试样25mg于25mL容量瓶中，加10mL水溶解样品，加入5mL0.1%氯胺T溶液、0.5mL0.05mol/L盐酸溶液，用水稀释至刻度，混匀，静置5min。准确量取1ml上述溶液于10mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，混匀。A.6.4.4
灵敏度溶液：准确量取1mL对照溶液于10mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，混匀。参考色谱条件
色谱柱：Cl色谱柱（柱长250mm，内径4.6mm.粒径5uμm），或其他等效色谱柱。A.6.5.2
流动相：取260mL甲醇和740mL磷酸氢二钠溶液（A.6.2.6）混匀.用磷酸调节pH至3.5。柱温：25℃。
检测器波长：361nm。
进样量：10μL。
运行时间：氰钻胺主峰保留时间的3倍。A.6.6
系统适用性试验
采用新制备的溶液，且避免强光照射。按照液相色谱仪操作规程操作，取系统适用性溶液（A.6.4.3）和灵敏度溶液（A.6.4.4）分别注入液相色谱仪中，观察色谱图。系统适用性溶液中应出现氰钻胺峰与一个降解产物峰（相对保留时间约为1.4），二者的分离度应大于2.5，灵敏度溶液中主峰的信噪比应大于3A.6.7测定
系统适用性合格后再进行试样检测。依次注人试样溶液（A.6.4.1）、对照溶液（A.6.4.2）进行测定。A.6.8结果计算
试样中有关物质的含量w3按式（A.3）计算，以%表示。A
×100%
A:×100
.......(A.3)
式中：
A试样溶液除主峰以外的所有杂质峰面积之和；A对照溶液主峰面积。
9精密度
GB1903.43—2020
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过其算术平均值的10%。A.7丙酮
试剂和材料
丙酮：色谱纯。
仪器和设备
天平：感量0.001g。
气相色谱仪：配有氢火焰离子化检测器（FID）和顶空进样器参考色谱条件
色谱柱：毛细管柱（柱长60m，内径0.32mm，膜厚1.6um，固定液为6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷)，或其他等效色谱柱。A.7.3.2
载气：氮气（纯度大于99.99%）。载气流量：1.5mL/min
柱温：40℃保持10min后，以20℃/min的速率升温至240℃，保持2min。进样口温度：140℃*
检测器温度：250℃。
检测器气体流量：空气.400mL/min：氢气，60mL/min：尾吹气.25mL/min。进样量：1.0mL。
分流比：1：50。
参考顶空条件
顶空瓶平衡温度：80℃。
平衡时间：45min
定量环温度：90℃。
传输线温度：100℃。
分析步骤
空白溶液制备
移取5.0mL水，置于顶空瓶中，迅速压紧瓶盖。A.7.5.2
标准溶液制备
称取0.1g丙酮（精确至0.001g）于已预加80mL水的100mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，得到1000mg/L的丙酮标准储备液。吸取适量的丙酮标准储备液于10mL容量瓶中，用水配制成10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的丙酮标准使用溶液，取上述系列溶液各5.0mL，7
分别置于顶空瓶中，迅速压紧瓶盖。A.7.5.3试样溶液制备
GB1903.43—2020
称取试样0.1g（精确至0.001g）于10mL容量瓶中，用水溶解后定容至刻度，摇匀·得到试样溶液。移取该溶液5.0mL置于顶空瓶中，迅速压紧瓶盖，备用。A.7.5.4测定
在参考条件下（A.7.3和A.7.4），分别对空白溶液、标准系列溶液和试样溶液进行测定，记录丙酮的峰面积值。丙酮的气相色谱图参见附录C中的图C.1。以标准系列溶液色谱图中丙酮的峰面积值为Y轴，以对应溶剂浓度（mg/L）为X轴，绘制标准曲线，得到丙酮标准曲线。根据试样溶液色谱图中丙酮的峰面积值，从标准曲线求得试样溶液中丙酮的浓度（mg/L）。A.7.6
结果计算
试样中丙酮的含量w·按式（A.4)计算。CxV
5×100%
×1000*1000
式中：
从标准曲线求得的试样溶液中丙酮的浓度，单位为毫克每升（mg/L）。V
试样溶液的体积，单位为毫升（mL）。m
试样的质量，单位为克（g）。
精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过其算术平均值的10%。....（A.4)
氰钻胺标准品红外光谱图
氰钻胺标准品的红外光谱图如图B.1所示。70
波数/cm-t
氰钴胺标准品的红外光谱图
GB1903.43—2020
丙酮的气相色谱图如图C.1所示。14
附录℃
丙酮气相色谱图
丙酮的气相色谱图
GB1903.43—2020
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