本标准适用于以粘着剑菌发酵法生产，经提纯、干燥制得的食品营养强化剂羟钴胺。

中华人民共和国国家标准
GB1903.442020
食品安全国家标准
食品营养强化剂
2020-09-11发布
羟钴胺
2021-03-11实施
中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局
1范围
食品安全国家标准
食品营养强化剂
羟钴胺
GB1903.442020
本标准适用于以粘着剑菌(Ensiferadhaerens)发酵法生产，经提纯、干燥制得的食品营养强化剂羟钴胺。
2分子式、结构式和相对分子质量2.1分子式
C62H:9CoN13O1sP
2.2结构式
2.3相对分子质量
1346.38（按2018年国际相对原子质量）3技术要求
3.1感官要求
感官要求应符合表1的规定。
表1感官要求
深红色
晶体或结晶性粉末
检验方法
取适量试样置于清洁、干燥的白瓷盘中，在自然光线下，观察其色泽和状态
理化指标
理化指标应符合表2的规定。
羟钻胺含量（以无水和无溶剂计)松/%水分，羟%
有关物质（以无水和无溶剂计）验/%丙酮、%
pH(20 a/L)
铅(Ph)/（ma/ka)
总确（以Asit）/（ma/ka)
表2理化指标
95.0~-102.0
14.0~18.0
搬1903.44—2020
检验方法
附录A.3
卡尔·费休法
附录A.4
附录A.5
附录A.6
GB5009.75或GB5009.12
GB5009.76或GB5009.11
籍1一般规定
附录梧
检验方法
搬1903.44—2020
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T6682中规定的一级水。试验方法中所用标准滴定溶液、杂质测定用标准溶液、制剂及制品，在没有注明其他要求时，均按GB/T601、GB/T602的规定制备。所用溶液在未注明用何种溶剂配制时，均指水溶液。培.2鉴别试验
试剂和溶液
..2.1.2
溴化钾。
焦硫酸钾。
2.1.3盐酸。
.2.1.4冰醋酸。
乙酸钠。
6酚指示液：0.1.g酚用,95%的乙醇溶解并定容到、100.ml焙2.1.6
花内客液：29称散48氧化：水生套502.1.%
容至500ml
移联葡酸钠溶液冰薄酸舌1 亚酶塞量攀酵苯用的溶于适量水中，转鲜基2紫阶36梦
籍211.9明
至 100 mL容量瓶中并用水定容。交
培.2.2红外光谱分析
红外光谱分析按GB/T6040—2002中5.2.2执行，试样的红外吸收光谱图应与盐酸羟胺的标准谱图一致，盐酸羟钻胺的标准红外光谱图如附录B的B.1所示焙.2.3钴离子鉴别
将,1.mg,羟钴胺和约 50.mg集硫酸钾放置于增蝎史,在电热板上逐渐势,真至圈体熔融，冷契,用玻璃棒捣碎，加大3m水，煮满真至溶蟹，温1滴酚大指示液，逐滴滴功氧氧花脑溶液(A215置到粉红色出现加入05g乙酸钠，0.5,mL醋酸溶液(A2.1.8和10.5mL1亚硝基2蔡酚36二磺酸钠溶液(2.1.9)立郎皇现红色或橘红色。加次0.5mL盆酸，煮沸1min红色或裔红爸保持不变。.2.4试样与标准溶液主峰保留时间的比较在羟钴胺含量项下试验中，试样溶液(A.3.2.9)与标准溶液(A.3.2.8)的主峰保留时间应一致。.3羟钴胺含量（以无水和无溶剂计）测定.3.1方法提要
用高效液相色谱法，在选定的工作条件下，通过色谱柱使样品分离，用紫外吸收检测器或二极管阵列检测器检测，用外标法定量，计算样品中羟钴胺的含量。.3.2
试剂和溶液
..3.2.1
焙.3.2.3
甲醇：色谱纯。
磷酸。
磷酸二氢钠。
盐酸羟钻胺标准品：CAS号为5946130.2质量分数大于95%.3.2.4
磷酸溶液:取 1 mL磷酸于 100 mL容量瓶中, 加水定容至刻度。搬1903.44—2020
.3.26缓冲液：称取 15.6 g磷酸二氢钠，溶于水，并定容至1 000mL用磷酸溶液(A3.2.5)调pH至生肢脲准体积传之漫盒格钻胺。9.2 g,精确至3稀瘩将甲醇度
8.001g,稀释液(A9.2.7稀释室200mL容量瓶中，是容作为标准溶液，使用前用 0.45gm微滤膜过滤，需做平行试样。
籍3.29截释落液；精密称取试样02.g,(按水分和溶剂残留之和折算后),精确至 0.01.g.用稀释液(A3.2.7)溶解并定容至200~mL,作为试样溶液，使用前用 0.45 μm 微孔滤膜过滤，需做平行试样。焙.3.3仪器和设备
.33.1电子天平，感量为0.1 mg。瘩.3.3.2高效液相色谱夜。
焙.3.4参考色谱条件
.3.4.1检测器：紫外检测器或二极管阵列检测器。替43 醇主两糖效高细度烷氧基硅胶为扎13 nm联或等效柱。
..3.4.4柱温：30℃。
进样量：20.ul
基硅胶为填料的整体柱 (柱长 10 cm,内径 4.6 mm,大孔 2 μm 中流动箱：≤为甲醇，B为缓冲液(A.3.2.6)，C为水。梯度洗脱条件见表A.1。表..1
流动相梯度洗脱条件
时间/min
.3.4.7
流速：2.0mL/min。
焙.3.5系统适用性
羟钻胺的保留时间大约
品敏控筑胶耐保备叫
内16min。
流动相
标准溶液(A.3.2.8)色谱峰的拖尾因子应不大于2.51903.44—2020
标准溶液(A.3.2.8)连续进样。次，主峰面积相对标准偏差(s)应不大于1.0% 。年次
.3.6分析步骤
按照液相色谱仪操作规程依法操作，取标准溶液(A.3.2.8)、试样溶液(A.3.2.9)各20uL注入液相JAHW
色谱仪中，记录色谱图，按外标法进行计算。..3.7结果计算
羟钻胺的质量分数拎数值以%表示获按罐A1罐算×100TtH
拎一杯-植
容液峰面积
经胺标准溶液浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)羟钴胺的摩尔质量，个346.4,单位为克每摩尔(g/mol);一棕准溶液峰面积
式祥溶液虽羟钻胺浓度，单位为毫克每毫升(mg/ml);T
一盐酸空钴胺的摩尔质量，T382.8单位为克每摩尔(g/mol)。..3.8精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过其算术平均值的 2%。N
培.4有关物质（以无水和无溶剂计）的测定试剂和溶液
..4.12
甲醇：色谱纯。
酸二氢钠(NaH2PO4·12H2O)。
缓中液：称取磷酸二氢钠_15.6g经漏斗倒入1.000.m容量瓶中,加少量水溶解_加水至刻度。14
经0.45.um微滤膜过滤，用1100磷磷酸容液调PH至3.0放入超声波水浴10min
精密量取经045.um.微子
滤膜过滤的水820mL取160mL缓冲液(A4.1.4)及倍4.1.5试程
样溶解液：
mL 甲醇进
放入超声波水浴
按纯度折掌后，精密称取适量盐酸羟钻胺标准品(A.3.2.4)用性溶液：
0.75mg/mL.
量瓶条使艺农度发8.75.mg/mL作为系统适用性溶液用轻定容至50
部.4.1.7
定量溶液：7.5ua/ml
分别精密量取系统适用性溶液（A.4.1.6)0.5mL角试样溶解液A.4.1.5)
50mL谷里比
倍.4.1.8 ~限度溶液:0.75.jg/mL*精密量取定量溶液(A.4.1.7)5mL用试样溶解液(A.4.1.5)溶解定容至50mL容量瓶中，作为限度溶液。.4.1.9试样溶液：0.75mg/mL。精密称取试样Q.037.5.g（按水分和溶剂残留之和折算后)，用试样溶解液(A.4.1.5)溶解定容至50mL容量瓶中，作为试样溶液焙.4.2仪器
倍.42.1电子天平，感量为0.01mg5
焙.4.2.2高效液相色谱仪，配备二极管阵列检测器或紫外检测器。.4.3参考色谱条件
同A3.4。
梧.4.4系统适用性
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液想色遭仪操作规程依法操作，取系统适用性瓷液(A41.620.u法入液相色遭仪中，记录色按照液相色谱仪操作规程依法操作。谱图，羟钴胺与其最近的杂质之间的峰谷比（与羟钴胺相邻的杂质小峰的峰高/羟钴胺主峰最低点的高度）必须不小于2.0。
焙.4.5分析步骤
按照液相色谱仪操作规程依法操作，取限度溶液(A.4.1.8)、试样溶液(A.4.1.9)和定量溶液(A.4.1.7)各20 注入液相色谱仪中，记录色谱图，按外标去进行计算。按外标法进行计算。
获得试样溶液（A，4.1.9)的色谱图，忽略面积小宇限度溶液（A.4.1.8)主峰的0.7倍的所有峰，将羟钻胺主峰保留时间设定为1，0，根据杂质峰与羟钻胺主峰相对保留时间记录杂质峰面积并计算其含量。杂质相对保留时间见表A.2。
B6羟甲基衍生物
B5羟甲基衍生物
杂质1
杂质2
杂质3
杂质4
C8异构体
杂质5
氰钴胺
任一其他杂质
焙.4.6结果计算
有关物质杂质峰相对保留时间
相对保留时间
1.37~1.51
羟钴胺有关物质的质量分数拎数值以%表示,按式(A.2)计算。种尿质辅药的质量分数按式(2x 糖。 100授2
式中：
基种丸质，的质分数
糖二晟样夜某不杂贵面积;
辖，一定量溶液中盐酸羟钴胺的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL);XEA
，一羟钴胺的摩尔质量，1.346.4单位为克每摩尔(g/mol)羟钴胺峰面积
潜一定量浴液(441-2)盐酸
第一街祥浴液A1年器
巢位为微克每毫升(ug/mL);
钻胺的浓度
置钻腰务
8真他杂质为
一盐酵轻钻胺的摩尔质量,1 382.8.单位为克每摩尔(g/mol)。.4.7精密度
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在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过其算术平均值的10%。.5丙酮含量的测定
培.5.1方法提要
试样中存在的丙酮在密闭容器中会扩散到气相中，经过一定的时间后可达到气相／液相间浓度的动态平衡，用顶空气相色谱法检测上层气相中丙酮的含量，即可计算出待测试样中丙酮的实际含量。焙.5.2试剂和溶液
.52 1.丙酮备液(1,000g/mL);用250 μL微量进样器量取.0.127 5.mL丙酮标准(20℃下内酮的密度为0.790-g/cm3）,置接注火色预水药80mL的106mL容量瓶中（针头必质没火液面以卡，再加水至刻度，摇匀，即得
.:522.丙酮标准使用液(50 μg/mL):量取丙酮备液(A.5.2.1)5.00mL置于100mL容量瓶中，加水刻度，摇鸡你
焙.523_试样溶液：取试样约(50+0.05)mg,置于20mL顶空瓶中，精密加入水5.0mL封瓶，超声使容解即得
焙.5.24参比溶液：取试样约(50+0.05)mg,置于20mL顶空瓶中，加入5.00mL丙酮标准使用液（A.5.2.2)，封瓶，超声使溶解，即得。.5.3仪器和设备
焙.5.3.1仪器：气相色谱仪，配顶空进样器和氢火焰离子化检测器。.532顶空瓶；20.mL配备铝盖和不含烃类溶剂残留的丁基橡胶或硅树脂胶隔垫1533电子天平，感量为8.8护mg
焙.5.4参考色谱条件
培54.1.包
色谱柱：毛细管柱(30mx0.53mmx3.0um,固定液为6%氰丙基苯基 94%二甲基聚硅氧烷)战等效柱。
..5.4.2柱温：40℃，保持13min。检测器温摩送智℃，进样口温度4么置，倍5.4.3
焙.544辈
载气:N2程流量：4'mL/min空气流量：400mL/min氢气流量：60mL/min,尾吹气流量25mL/min：分流比：2
进样方式；顶空进样，进样量1.8 mL545
.:5.4.6 顶空进样器条件： 顶空瓶平衡温度 80 ℃,平衡时间 60 min,定量环温度 100 ℃;传输线温度100℃
焙.5.5系统适用性试验
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试样检测前进行系统适用性试验，以丙酮标准使用液（A.5.2.2)连续进样5次进行重复性测试，并计算其峰面积的相对标准偏差 RSD,要求重复性测试的 RSD不大于10.0%，,同时，记录第一针丙酮标准使用液(A.5.2.2)中丙酮峰的理论板数，理论板数应不小于5000。满足条件后进行试样的正常检测；若不满足，查明原因后继续进行系统适用性测试，合格后再进行试样测试。每进5批试样及检测结束前取丙酮标准使用液（A.5.2.2)进样，与开始5针系统适用性的峰面积及中间每次确认的丙酮标准峰面积一并计算，重复性测试的相对标售偏差,RSD不大于 100% 内哪标准准使用液(A.5.2.2)中丙酮峰的理论板数应果尔手冬品署朵满是述条件，则之高的检测数据芜数。“量新进存素统造角性检测，累统适用性合格后，重新检测，系统适用性48 h有效。焙.5.6分析步骤
系统适用性5针重复性合格后，进1针水样，再依次进2针参比溶液（A，5，2.4)2针试样溶液A5.23)静制蜂好的溶液(价是2.4/善密液(A52.3)在80 ℃下平衡 60 min,分别取顶空气A5 2元进神+择好增繁率个是;4 密着图夜焙.5.7结果计算
丙酮的质量分数拎,数值以%奏示，按式(A.4)计算（倍+）异-10×100
二样胖度2年糖用激的赢为;1gm;5°二参比溶液(A引:2.4)中芮酮棕催用液的保积，粒为毫并(m);焙一试样溶液峰面积：
籍0一参比溶液峰面积；
养一试样质量，单位为克(g)。
焙.5.8精密度
.A4）
结果否大玉,100mg/kg-时+两企平行试样的绝对差值不应超过20mg/kg结果大于100mg/kg时，两不平行试样的绝对差值不超过算术平均值的“15.0%。N
..6独的测定
取试样2.0g,用水溶解，并定容至100mL其他按GB/T9724规定测定8
附录B
羟钴胺参考红外光谱图和色谱图盐酸羟钻胺的标准红外光谱图
见图B.1。
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羟钻胺试样参考色谱图
见图B.2。
波数/em
盐酸羟钴胺的标准红外光谱图
5.0010.0015.0020.0025.0030.0035.0040.0045.0050.00t/min
羟钴胺试样有关物质参考色谱图见图B.3。
羟钻胺试样参考色谱图
1903.442020
2.03.004005.006.07.08.00
说期：
B6羟甲基衍生物：
B5羟甲基衍生物：
杂质1：
杂质2：
杂质4；
C8异构体；
杂质5；
8一一氟钻胺。
羟钴胺试样丙酮参考色谱图
见图B.4。
1903.442020
_010.001.012.03.004015.06.001.018.019.002021.022023.00240025.026027.028.02.03031.03203.034.085.06.00Umin
羟钻胺试样有关物质参考色谱图19
羟钴胺试样丙酮参考色谱图
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