本标准规定了食品中1-甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于炼乳、冷冻饮品、果酱、豆制品、可可及巧克力制品、糖果、小麦粉制品、饼干、焰料及表面挂浆、肉制品、调味糖浆、调味品（酱油、醋、酱及酱制品、料酒、复合调味料）、饮料、酒类、果冻及膨化食品中1-甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑含量的测定。

中华人民共和国国家标准
GB 5009.282—2020
食品安全国家标准
食品中1-甲基咪唑、2-甲基咪唑及　4-甲基咪唑的测定
2020-09-11发布
2021-03-11实施
中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局　
1范围
食品安全国家标准
食品中1-甲基咪唑、2-甲基咪唑及4-甲基咪唑的测定
GB5009.282—2020
本标准规定了食品中1-甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于炼乳、冷冻饮品、果酱、豆制品、可可及巧克力制品、糖果、小麦粉制品、饼干、馅料及表面挂浆、肉制品、调味糖浆、调味品（酱油、醋、酱及酱制品、料酒、复合调味料)、饮料、酒类、果冻及膨化食品中1-甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑含量的测定。2原理
试样加同位素内标后，采用水或酸水提取，经固相萃取柱净化、浓缩，用液相色谱-串联质谱仪测定同位素内标法定量。
试剂和材料
除另有说明外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂
乙腈(CH3 CN)：
色谱纯。
3.1.2甲 醇(CH3 OH):
甲酸(HCOOH):
氨水(NH4 OH):
色谱纯。
色谱纯。
浓度25%~28%。
正已烷(CH3（CH2）4CH3):
乙酸铵(CH3COONH4):
氯化钠(NaCI)
3.2试剂配制
色谱纯。
色谱纯。
3.2.12%甲酸水溶液：量取20mL甲酸，加入到980mL水中，混匀。3.2.2氨水甲醇溶液：量取50mL氨水，加入到950mL甲醇中，混匀。3.2.3乙酸铵溶液（5mmol/L)：称取0.39g乙酸铵，溶于1000mL水中，混匀。3.2.4乙腈-乙酸铵溶液（9+1）：将乙腈和乙酸铵溶液（5mmol/L）按9：1的体积比混合均匀。3.3标准品
3.3.11-甲基咪唑标准品
(C4 H。 N2 ,CAS
证书的标准物质。
3.3.22-甲基咪唑标准品
(C4 He N2 ,CAS
号：616-47-7）：纯度≥98%，或为经国家认证并授予标准物质号：693-98-1）：纯度98%，或为经国家认证并授予标准物质1
证书的标准物质。
3.3.34-甲基咪唑标准品(C4H。N2,CAS准物质证书的标准物质。
GB5009.282—2020
号：822-36-6）：纯度≥98%，或为经国家认证并授予标3.3.4同位素内标1-甲基咪唑-D6（C4D。N2,CAS号：285978-27-0)：纯度≥98%。3.3.5同位素内标2-甲基咪唑-D。（C4DN2,CAS号：1173022-19-9）：纯度≥98%。3.3.6同位素内标4-甲基咪唑-D（C4DeN2,CAS号：1219804-79-1）：纯度≥98%。3.4标准溶液配制
3.4.1标准储备溶液（1mg/mL)：准确称取1-甲基咪唑标准品25mg（精确至0.01mg)，加水1mL使其溶解，用乙睛转移至25mL棕色容量瓶中并定容至刻度，摇匀。分别准确称取2-甲基咪唑、4-甲基咪唑标准品25mg（精确至0.01mg)，用乙睛溶解，转移至25mL棕色容量瓶中并定容至刻度，摇匀。-20℃下避光密封保存，有效期6个月。3.4.2混合标准工作溶液（2.0μg/mL)：分别吸取上述标准储备溶液各100μL于同一50mL棕色容量瓶中，加乙腈稀释定容至刻度，摇匀，得2.0ug/mL的混合标准溶液。此溶液4℃以下避光密封保存，有效期3个月。
3.4.3同位素内标储备溶液（1mg/mL）：分别准确称取1-甲基咪唑-D6、2-甲基咪唑-D和4-甲基咪唑-D6各10mg（精确至1mg)，用乙晴溶解，转移至10mL棕色容量瓶中定容至刻度，摇匀。-20℃下避光密封保存，有效期6个月。
3.4.4同位素内标混合工作溶液（1.0ug/mL）：分别吸取上述同位素内标储备溶液各100μL于同一100mL棕色容量瓶中，用乙稀释定容至刻度，摇匀，得1.0μg/mL的同位素内标混合工作溶液。此溶液4℃避光密封保存，有效期3个月。3.4.5标准系列溶液：分别吸取混合标准工作溶液25μL、75μL、150μL、300μL、600μL、1000μL至5mL棕色容量瓶中，分别加入250μL的同位素内标混合工作溶液，用乙睛-乙酸铵溶液（9+1）混合溶液定容至刻度，配制成1-甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的混合标准系列溶液，质量浓度为10ng/mL、30ng/mL、60ng/mL、120ng/mL、240ng/mL、400ng/mL。在实际样品测定中，可根据样品浓度调整同位素内标混合工作溶液加入量及稀释倍数。3.5材料
混合型阳离子交换固相萃取小柱：N-乙烯吡咯烷酮-二乙烯基苯共聚物基质-磺酸基，150mg，3.5.1
6mL，或性能相当者。使用前依次用5mL甲醇活化，再用5mL水淋洗平衡。3.5.2均质子：适用于50mL离心管。3.5.3有机系滤膜：孔径为0.22μm。注：3.5.1、3.5.2、3.5.3在使用前均应做本底试验，确定无干扰后方可使用。仪器和设备
液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源(ESI)4.1
4.2分析天平：感量0.001g和0.00001g。4.3移液器：最大量程200μL和1000μL4.4均质器。
4.5涡旋混合器。
4.6恒温水浴装置。
4.7超声波清洗器：功率≥250W。4.8高速离心机：转速≥10000r/min。4.9固相萃取装置。
4.10氮吹浓缩装置。
5分析步骤
5.1样品前处理
5.1.1试样制备
GB5009.282—2020
取适量有代表性的样品，饮料等液态均匀样品直接摇匀；非均匀的样品需匀浆或粉碎均匀，冷冻饮品室温融化后充分搅拌均匀，必要时可30℃~40℃水浴加热搅拌，酱类等可以采用研磨或者均质混匀，巧克力等采用50℃60℃加热熔融，并趁热充分搅拌均匀。5.1.2试样提取
5.1.2.1液体试样(如酱油、醋、饮料、酒类等）称取2g混合均匀的试样（精确至0.001g)，置20mL刻度比色管中，加入1.0μg/mL同位素内标混合工作溶液100μL，加2%甲酸水溶液定容至20mL，摇匀，置离心管中，以10000r/min离心5min，上清液待净化。
5.1.2.2半流体试样(如果酱、蚝油、调味糖浆、冷冻饮品等)及胶基糖果、粉圆称取2g混合均匀的试样（精确至0.001g)，置50mL离心管中，加入1.0μg/mL同位素内标混合工作溶液100μL，混匀，准确加入水20mL，涡旋1min,70℃水浴加热10min，冷却至室温后，超声提取20min，以10000r/min在4℃下离心5min，上清液待净化。5.1.2.3果冻
称取2g混合均匀的试样（精确至0.001g)，置50mL离心管中，加入1.0μg/mL同位素内标混合工作溶液100μL，混匀，加入2g氯化钠，准确加入水20mL，涡旋1min,70℃水浴加热10min，冷却至室温后，超声提取20min，以10000r/min在4℃下离心5min，上清液待净化。5.1.2.4炼乳、可可及巧克力制品称取2g混合均匀的试样（精确至0.001g)，置50mL离心管中，加入1.0μg/mL同位素内标混合工作溶液100uL，混匀，准确加入2%甲酸水溶液20mL,60℃水浴加热5min，加入2颗均质子，涡旋5min，以10000r/min离心5min，上清液待净化。5.1.2.5豆制品、酱及酱制品等其他试样称取2g混合均匀的试样（精确至0.001g)，置50mL离心管中，加入1.0μg/mL同位素内标混合工作溶液100μL，混匀，准确加入水20mL，均质1min，以10000r/min在4℃下离心5min，上清液待净化。
5.1.3试样净化
5.1.3.1酱油、醋、饮料、酒、炼乳、可可及巧克力制品吸取10mL上清液，过固相萃取小柱，依次用2%甲酸水溶液5mL，甲醇5mL淋洗，再用氨水甲醇溶液10mL洗脱，收集全部洗脱液，45℃以下氮吹至近干，准确加入乙睛-乙酸铵溶液（9+1）1mL，涡旋30s，过0.22um有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪测定，5.1.3.2蚝油
吸取10mL上清液，加甲酸200μL混匀酸化，必要时过滤，过固相萃取小柱，依次用2%甲酸水溶3
GB 5009.282—2020
液5mL，乙睛5mL淋洗，抽干，1.5mL正已烷淋洗两次，抽干，再用氨水甲醇溶液10mL洗脱，收集全部洗脱液，45℃以下氮吹至近干，准确加入乙腈-乙酸铵溶液（9+1)1mL，涡旋30s，过0.22μm有机系滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪测定。5.1.3.3除5.1.3.1、5.1.3.2外的其他基质吸取10mL上清液，加甲酸200μL混匀酸化，必要时过滤，过固相萃取小柱，依次用2%甲酸水溶液5mL，甲醇5mL淋洗，再用氨水甲醇溶液10mL洗脱，收集全部洗脱液，45℃以下氮吹至近干，准确加入乙晴-乙酸铵溶液（9+1）1mL，涡旋30S，过0.22μm有机系滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪测定。
5.2仪器参考条件
5.2.1液相色谱参考条件
液相色谱参考条件列出如下：
a）液相色谱柱：HILIC色谱柱（2.1mmx100b）色谱柱柱温：35℃。
mm,3.5um),或性能相当色谱柱
c）流动相：（A）乙腈；(B)5mmol/L乙酸铵溶液；洗脱梯度参考条件见表1。d）流速：0.6mL/min。bzxz.net
e）进样体积：2μL。
表1色谱洗脱梯度参考条件
时间/min
5.2.2质谱参考条件
质谱参考条件如下：
流动相A/%
a）离子化模式：电喷雾电离正离子模式。b）质谱扫描方式：多反应离子监测(MRM)。c）其他参考质谱条件：见附录A。5.3定性测定
5.3.1保留时间
流动相B/%
流速/（mL/min）
试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在土2.5%之内。
5.3.2定量离子、定性离子及相对离子丰度比每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检验批次，4
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对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表2规定的范围。
表2定性时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度/%
允许相对偏差/%
5.4定量测定
5.4.1标准曲线的制作
20～50
10～20
将标准系列溶液由低到高进样检测，以被测组分浓度与对应内标浓度比值为横坐标，被测组分色谱峰面积与对应内标色谱峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程。标准品色谱图参见附录B图B.1。5.4.2试样溶液的测定
将试样溶液同标准系列溶液进样测定，计算样品中待测物的含量。5.5空白试验
不称取试样，按照5.1做空白试验。应确认不含有干扰待测组分的物质。6分析结果的表述
试样中目标化合物的含量按式（1）计算：X=XV×f×1000
×1000
式中：
试样中待测组分的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；试样溶液中待测组分的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；样品经固相萃取柱净化洗脱后的最终定容体积，单位为毫升（mL）；样液的稀释因子；
试样的称样量，单位为克（g）；1000一一换算系数；
计算结果保留3位有效数字。
7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。8其他
（1）
当取样量为2g时，1-甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑在咖啡饮料、植物饮料中的检出限为3μg/kg，定量限为10μg/kg；在其他基质中的检出限为10μg/kg，定量限为30μg/kg。5
参考质谱条件如下：
a）毛细管电压：0.5kV
锥孔电压：30V;
脱溶剂温度：500
脱溶剂气流量：1000L/h；
锥孔气流量：150L/h;
碰撞气：氩气；
其他质谱参数见表A.1。
化合物名称
1-甲基咪唑
(1-Methylimidazole)
2-甲基咪唑
(2-Methylimidazole)
4-甲基咪唑
(4-Methylimidazole)
1-甲基咪唑-D6
2-甲基咪唑-D6
4-甲基咪唑-D6
附录A
参考质谱条件
母离子/（m/z）
参考质谱参数
子离子/(m/z）
锥孔电压/V
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碰撞电压/ev
注1：质谱条件仅供参考，当采用不同质谱仪器时，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。注2：“为定量离子。
附录B
标准品色谱图
标准品多反应监测(MRM）色谱图见图B.1。×10=|89. 1->61.11-甲基咪唑-d61.675
×10389.1->45.11-甲基咪唑-d66-
488.1->44.1
×10488.1->60.1
2-甲基咪唑-d6
4-甲基咪唑-d6
+83.1->42.11-甲基咪唑
83.1->56.1
4-甲基咪唑
4-甲基咪唑
1-甲基咪唑
2-甲蒸咪唑
2-甲基咪唑
66.577.58
标准品多反应监测(MRM）色谱图5009.282—2020
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