本标准规定了食品中N-二甲基亚硝胺（NDMA）的测定方法。 本标准适用于肉及肉制品、水产动物及其制品中N-二甲基亚硝胺的测定。
本标准代替GB 5009.26-2016《食品安全国家标准 食品中N-亚硝胺类化合物的测定》。
本标准与GB 5009.26-2016相比，主要变化如下：
——增加了第一法水蒸气蒸馏-气相色谱法-质谱/质谱法；
——增加了第二法QuEChERS-气相色谱-质谱/质谱法；
——增加了第三法水蒸所蒸馏-液相色谱-质谱/质谱法；
——删除了气相色谱-质谱法；
——修改了原第二法气相色谱-热能分析仪法为第四法；
——修改了前处理蒸馏法条件、气相色谱-热能分析仪法的检出限和定量限。

中华人民共和国国家标准
GB5009.26—2023
食品安全国家标准
食品中N-亚硝胺类化合物的测定2023-09-06发布
中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局
2024-03-06实施
GB5009.26—2023
本标准代替GB5009.26一2016《食品安全国家标准食品中N-亚硝胺类化合物的测定》。本标准与GB5009.26—2016相比，主要变化如下：增加了第一法水蒸气蒸馏-气相色谱-质谱/质谱法；增加了第二法QuEChERS-气相色谱-质谱/质谱法；增加了第三法水蒸气蒸馏-液相色谱-质谱/质谱法；删除了气相色谱-质谱法；
修改了原第二法气相色谱-热能分析仪法为第四法；一一修改了前处理蒸馏法条件、气相色谱-热能分析仪法的检出限和定量限。1范围
食品安全国家标准
食品中N-亚硝胺类化合物的测定本标准规定了食品中N-二甲基亚硝胺（NDMA)的测定方法本标准适用于肉及肉制品、水产动物及其制品中N-二甲基亚硝胺的测定第一法水蒸气蒸馏-气相色谱-质谱/质谱法2原理
GB5009.26—2023
本法以N-二甲基亚硝胺-D。为内标，试样中加人内标，经水蒸气蒸馏，样品中的N-二甲基亚硝胺通过二氯甲烷吸收，液液萃取分离，采用气相色谱-质谱/质谱仪（GC-MS/MS）测定，内标法定量试剂与材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水3.1试剂
3.1.1二氯甲烷（CH,Cl）：色谱纯3.1.2浓硫酸（H,SO,)：18.4mol/L。3.1.3异辛烷（CgHis）：色谱纯。3.1.4无水硫酸钠（Na,SO,)。
氯化钠（NaCI)：优级纯
试剂配制
硫酸溶液（1十3）：量取30mL浓硫酸，缓缓倒人90mL冷水中，一边搅拌使得充分散热，冷却后小心混匀。
3.3标准品
3.3.1N-二甲基亚硝胺标准溶液（CH.NO.CAS号：62-75-9）：质量浓度为1000μg/mL的N-二甲基亚硝胺甲醇溶液，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。3.3.2N-二甲基亚硝胺-D。内标标准溶液（NDMA-D，C,DN,O.CAS号：17829-05-9）：质量浓度为1000μg/mL，溶剂为甲醇。
3.4标准溶液配制
3.4.1N-二甲基亚硝胺标准储备液（100μg/mL）：准确吸取1.0mLN-二甲基亚硝胺标准溶液（1000ug/mL）.置于10mL容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度，混匀。将溶液转移至棕色玻璃容器内，GB5009.26—2023
一18℃避光保存，保存期6个月。3.4.2N-二甲基亚硝胺标准中间液（1ug/mL）：准确吸取1.0mLN-二甲基亚硝胺标准储备溶液（100ug/mL），置于100mL容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度，混匀。将溶液转移至棕色玻璃容器内，一18℃避光保存，保存期3个月。3.4.3N-二甲基亚硝胺-D。内标储备液（100ug/mL)：准确吸取N-二甲基亚硝胺-D。标准溶液1.0mL，置于10mL容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度，混匀。将溶液转移至棕色玻璃容器内，一18℃避光保存，保存期6个月。
3.4.4N-二甲基亚硝胺-D。内标中间液（1ug/mL)：准确吸取N-二甲基亚硝胺-D。内标储备液1.0mL，置于100mL容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度，混匀。将溶液转移至棕色玻璃容器内，一18℃避光保存，保存期3个月。
3.4.5N-二甲基亚硝胺标准及内标混合系列工作液：分别准确吸取N-二甲基亚硝胺标准中间液（1μg/mL)0.1mL.0.2mL0.5mL、1.0mL和2.0mL，置于10mL容量瓶中，各加内标中间液（1μg/mL）0.4mL.用二氯甲烷定容至刻度，混勾。N-二甲基亚硝胺标准系列工作溶液质量浓度为10g/L、20ug/L，50ug/L，100ug/L和200μg/L，其中内标的质量浓度均为40μg/L。临用现配仪器和设备
4.1气相色谱-质谱/质谱联用仪（GC-MS/MS)。4.2
旋转蒸发仪
全玻璃水蒸气蒸馏装置或全自动水蒸气蒸馏装置（见附录A中图A.1）4.4
氮吹仪。
电子天平：感量为0.001g。
制冰机。
冷却水制备机。
水浴锅。
10mL带刻度试管。
100μL～1000μL移液器或分度吸量管5分析步骤
样品前处理
5.1.1试样制备
代表性样品取可食部分捣碎后，制备成均匀试样，装人洁净的容器，密封并做好标识。试样于一18℃冷冻保存，备用。
5.1.2提取
准确称取20g（精确到0.01g）试样，加人N-二甲基亚硝胺内标标准中间液（1ug/mL）40uL，加人100mL水和50g氯化钠于蒸馏瓶（管）中，充分混匀。载样前后均需进行气密性检查。在250mL三角烧瓶中加入50mL二氯甲烷、0.5mL异辛烷，冷凝管（冷却水温度控制在10℃~15℃）出口伸人二氯甲烷液面下，并将三角烧瓶置手冰浴中，开启蒸馏装置加热蒸馏（参考条件：自动蒸馏装置蒸汽功率设置为50%），收集200mL~250mL冷凝液（包含50mL二氯甲烷提取液）后关闭加热装置，停止蒸馏。注：蒸汽功率设置目的为控制蒸汽量，蒸汽加热样品时不致使样品瀑沸至蒸管腔体外。2
5.1.3净化
GB5009.26—2023
在盛有冷凝液的三角瓶中加入15g氯化钠和2mL硫酸溶液，搅拌使氯化钠完全溶解。然后将溶液转移至500mL分液漏斗中，振荡5min，必要时放气.静置分层后，将二氯甲烷层转移至另一圆底烧瓶中，再用120mL二氯甲烷分3次萃取，每次40mL萃取，合并4次二氯甲烷萃取液，总体积约为170ml
5.1.4浓缩
将二氯甲烷萃取液用10g无水硫酸钠脱水后，于5℃~18℃水浴温度条件下旋转蒸发浓缩至5mL~10mL，转人试管中，控制氮吹温度在18℃~25℃，氮吹（参考条件：氮吹流速1L/min）至近干（0.3mL~0.8mL）.用二氯甲烷溶解残渣，准确定容至1.0mL.上机检测。注：控制氮吹流速，不致使液体飞溅管壁。5.2
仪器参考条件
气相色谱条件
色谱柱：强极性石英毛细管WAX柱，固定相为聚乙二醇［30mX0.25mm（内径）×0.25μm（膜厚），或相当者。
进样口温度：220℃。
载气：氢气，纯度≥99.999%；流速1mL/min。进样方式：不分流进样。
进样量：1uL
升温程序：初始温度40℃，以10℃/min升至80℃，以1℃/min升至90℃，再以30℃/min升至240℃，保持2min。
质谱/质谱条件
离子源温度：250℃。
色谱与质谱接口温度：250℃。
电离方式：电子轰击源（EI源）。d)
电离能量：70eV。
溶剂延迟：6min。
四级杆温度：150℃。
监测模式：多反应监测（MRM)模式，离子对参数见表1。表1N-二甲基亚硝胺及其内标的监测离子对目标物
NDMA-D：（内标物）
3标准曲线的制作
定量离子对
74.0/44.0
80.0/50.1
定量离子对碰撞能/eV
定性离子对
74.0/42.1
定性离子对碰撞能/eV
将N-二甲基亚硝胺标准及内标混合系列工作溶液按浓度由低到高的顺序注入气相色谱-质谱/质谱仪进样分析，以N-二甲基亚硝胺的质量浓度为横坐标，以N-二甲基亚硝胺及其对应氛代同位素内标的峰3
GB5009.26—2023
面积比值为纵坐标，绘制标准曲线。N-二甲基亚硝胺标准溶液的色谱图参见附录B中图B.1和图B.2。5.4试样溶液的测定
5.4.1定性测定
按照5.2所述条件测定试样和标准系列工作溶液，试样的质量色谱峰保留时间应与标准物质一致，允许偏差小于士0.5%，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现且信噪比≥3，而且定性离子对的相对丰度（是用相对于最强离子丰度的强度百分比表示）与浓度相当的标准使用溶液的相对丰度允许偏差不超过表2规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物表2定性时相对离子丰度的最大充许偏差相对离子丰度
允许的最大偏差
5.4.2定量测定
20%~50%（含）
10%~20%（含）
将试样溶液注入气相色谱-质谱/质谱仪中，得到N-二甲基亚硝胺的峰面积与对应同位素内标的峰面积的比值，根据标准曲线得到试样溶液中被测化合物的浓度。样液中N-二甲基亚硝胺的峰面积比值应在标准曲线的线性范围内：如果含量超过标准曲线范围，需调整称样量或定容体积重新检测，者调整定容体积，应调整内标的添加量，使最终定容后内标与标准曲线内标的质量浓度一致。5.5空白试验
用水代替试样，按5.1及5.2所述操作步骤进行，必要时，进行环境空白的测定，空白测定值需低于该方法的定量限的50%。
6分析结果的表述
试样中N-二甲基亚硝胺含量按式(1)计算。X=(-po)×V×1000
m×1000
式中：
试样中N-二甲基亚硝胺的含量，单位为微克每千克（ug/kg)；（1)
试样中N-二甲基亚硝胺色谱峰与对应内标物色谱峰的峰面积比值，经标准曲线求得的对应N-二甲基亚硝胺质量浓度，单位为微克每升（μg/L)：空白试验溶液中N-二甲基亚硝胺色谱峰与对应内标物色谱峰的峰面积比值，经标准曲线求得的对应N-二甲基亚硝胺质量浓度，单位为微克每升（μg/L)；试液最终定容体积，单位为毫升（mL）：换算系数：
试样的质量，单位为克（g）。
计算结果保留小数点后2位数字。7精密度
在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。4
8其他
8.1方法检测限
GB5009.26—2023
称样量为20g?定容体积为1.0mL时，本方法检出限为0.30μg/kg，定量限为1.00μg/kg8.2安全警示
本试验所涉及的对人体可能造成危害的试剂包括有机溶剂（如乙睛、正已烷）等。试验人员有可能因接触这些物质而带来风险，因而，涉及这些物质的试验操作中应在通风橱内进行，并佩戴专业的防护工具（如手套、口罩等）。
亚硝胺类化合物是强致癌物，试验结束后，随意丢弃这些物质可能会对人员及环境造成损害，同时在处理不当时，试验用的N-二甲基亚硝胺标准品及过期标准物质也可能带来风险，因而，在试验过程中不得随意丢弃这些物质，应分别回收在密闭容器并保存在远离火源、通风良好的环境中。第二法QuEChERS-气相色谱-质谱/质谱法9原理
本法以N-二甲基亚硝胺-D为内标，试样中加人内标，试样中的N-二甲基亚硝胺经乙腈提取，基质分散萃取填料净化，采用气相色谱-质谱/质谱仪测定，内标法定量。10试剂与材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。10.1试剂
乙腈（CHN）：色谱纯。
10.1.2硫酸镁（MgSO,）。
10.1.3氯化钠（NaCI)：优级纯
10.1.4PLS-A粉末：吡咯烷酮修饰聚苯乙烯二乙烯苯聚合物粉末或EMR-Lipid萃取粉剂：增强型去脂分散粉末。
5微孔滤膜（0.22μm）,有机相型。10.2标准品
同3.3。
10.3标准溶液配制
10.3.1N-二甲基亚硝胺标准储备液（100μg/mL）：准确吸取1.0mLN-二甲基亚硝胺标准溶液，置于10mL容量瓶中，用乙定容至刻度，混匀。将溶液转移至棕色玻璃容器内。一18℃避光保存，保存期6个月。
10.3.2N-二甲基亚硝胺标准中间液（1μg/mL)：准确吸取1.0mLN-二甲基亚硝胺标准储备溶液（100μg/mL），置于100mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混勾。将溶液转移至棕色玻璃容器内。5
GB5009.26—2023
一18℃避光保存，保存期3个月。10.3.3N-二甲基亚硝胺-D。内标储备液（100ug/mL)：准确吸取N-二甲基亚硝胺-D。标准溶液1.0mL，置于10mL容量瓶中，用乙睛定容至刻度，混。将溶液转移至棕色玻璃容器内。一18℃避光保存，保存期6个月。
10.3.4N-二甲基亚硝胺-D。内标中间液（1μg/mL）：准确吸取N-二甲基亚硝胺-D。内标储备液1.0mL，置于100mL容量瓶中，用乙定容至刻度.混匀。将溶液转移至棕色玻璃容器内。一18℃避光保存，保存期3个月。
10.3.5N-二甲基亚硝胺标准及内标混合系列工作液：分别准确吸取N-二甲基亚硝胺标准中间液(1μg/mL)0.005mL0.01mL0.02mL0.05mL0.1mL和0.2mL，置于10mL容量瓶中，各加人内标中间液（1μg/mL)0.05mL用乙睛定容至刻度，混匀。N-二甲基亚硝胺标准系列工作溶液质量浓度为0.5ug/L、1ug/L、2μg/L5μg/L、10ug/L和20μg/L，其中内标的质量浓度均为5ug/L。临用现配。
仪器和设备
11.1气相色谱-质谱/质谱仪（GC-MS/MS），配备大体积程序升温进样口。11.2电子天平：感量为0.001g。11.3振荡器。
11.4冷冻离心机。
11.5离心管：50mL、15mL。
陶瓷均质子。
分析步骤
样品前处理
试样制备
同5.1.1。
12.1.2提取
干制品称取5g（精确到0.01g）于50mL离心管.加人5mL水，振荡混匀[鲜样品称取10g（精确到0.01g）置于50mL离心管中，加人N-二甲基亚硝胺内标中间液（1μg/mL)50μL，向其准确加人10mL乙腊，涡旋振荡2min，置于一20℃冰箱冷冻20min，加人陶瓷均质子1粒以及4g硫酸镁和1g氯化钠，涡旋振荡2min，置于冷冻离心机中，转速9000r/min，10℃离心5min，上清液待净化12.1.3净化
称取150mgPLS-A粉末（或1g增强型脂质去除EMR-Lipid萃取粉剂或同级品）于15mL.离心管中，加入5mL水涡旋振荡，立即加人5mL12.1.2中的上清液涡旋振荡1min，置于冷冻离心机，9o00r/min，10℃离心5min。
12.1.4除水
称取1.6g硫酸镁和0.4g氯化钠于另一15mL离心管加入12.1.3的净化液涡旋振荡2min，置于冷冻离心机中，转速9000r/min，10℃离心5min。取上层有机相经0.22um微孔滤膜过滤后，上机6
测定。
注：试验需在通风橱中进行，并佩戴专业的防护工具（如口罩、手套等）。12.2
仪器参考条件
气相色谱条件
GB5009.26—2023
色谱柱：强极性石英毛细管柱[30mX0.25mm（内径)×0.25μum（膜厚)]，或相当者。进样口温度：初始温度50℃保留0.16min，900℃/min升至220℃保持5min。进样口溶剂放空模式：放空时间0.16min，放空流量50mL/min。载气：氮气，纯度≥99.999%，流速1mL/min。进样方式：不分流进样。
进样量：5μL。
升温程序：初始温度40℃，以10℃/min升至80℃，以1℃/min升至100℃，再以20℃/min升至240℃，保持2min。
质谱/质谱条件
离子源温度：250℃。
色谱与质谱接口温度：250℃。
电离方式：电子轰击源（EI源）。电离能量：70eV。
溶剂延迟：6min。
四级杆温度：150℃。www.bzxz.net
监测模式：多反应监测（MRM)模式，离子对参数见表3。N-二甲基亚硝胺及其内标的监测离子对表3
目标物
NDMA-D（内标物）
标准曲线的制作
同5.3。
试样溶液的测定
同5.4。
空白试验
定量离子对
74.0/44.0
80.0/50.1
定量离子对碰撞能/eV
定性离子对
74.0/42.1
定性离子对碰撞能/eV
用乙睛代替试样，按12.1及12.2所述操作步骤进行，空白测定值需低于该方法的定量限的50%。13
分析结果的表述
试样中N-二甲基亚硝胺含量按式(2)计算X=(-po)×V×1000
mx1000
GB5009.26—2023
式中：
试样中N-二甲基亚硝胺的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；试样中N-二甲基亚硝胺色谱峰与对应内标物色谱峰的峰面积比值，经标准曲线求得的对应N-二甲基亚硝胺质量浓度，单位为微克每升（ug/L）；空白试验溶液中N-二甲基亚硝胺色谱峰与对应内标物色谱峰的峰面积比值，经标准曲线求得的对应N-二甲基亚硝胺质量浓度，单位为微克每升（ug/L)：试液最终定容体积，单位为毫升（mL）；1000
换算系数：
试样的质量，单位为克（g）。
计算结果保留小数点后2位数字。14
精密度
在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。15其他
15.1方法检测限
称样量为5g，定容体积为10mL时，检出限为0.30μg/kg定量限为1.00μg/kg。称样量为10g，定容体积为10mL时，检出限为0.15ug/kg，定量限为0.50μg/kg15.2安全警示
本试验所涉及的对人体可能造成危害的试剂包括有机溶剂（如乙睛、正已烷）等。试验人员有可能因接触这些物质而带来风险，因而，涉及这些物质的试验操作中应在通风橱内进行，并佩戴专业的防护工具（如手套、口罩等）。
亚硝胺类化合物是强致癌物，试验结束后，随意丢弃这些物质可能会对人员及环境造成损害，同时，在处理不当时，试验用的N-二甲基亚硝胺标准品及过期标准物质也可能带来风险，因而，在试验过程中不得随意丢弃这此物质，应分别回收在密闭容器并保存在远离火源，通风良好的环境中水蒸气蒸馏-液相色谱-质谱/质谱法第三法
S原理
本法以N-二甲基亚硝胺-D为内标，试样中加人内标，经水蒸气蒸馏，样品中的N-二甲基亚硝胺随着蒸气通过二氯甲烷吸收，液液萃取分离，采用液相色谱-质谱/质谱仪（LC-MS/MS）测定，内标法定量。
试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。17.1试剂
二氯甲烷（CH,Cl,）：色谱纯。17.1.1
浓硫酸（H，SO)：18.4mol/L。
异辛烷（C,Hs）：色谱纯。
甲醇（CH,O)：色谱纯。
无水硫酸钠（Na,SO,)。
氯化钠（NaCI）：优级纯。
甲酸（HCOOH）：色谱纯。
试剂配制
GB5009.26—2023
硫酸溶液（1十3）：量取30mL浓硫酸，缓缓倒入90mL冷水中，一边搅拌使得充分散热，冷却后小心混勾。
0.1%甲酸水溶液：吸取1mL甲酸至1L容量瓶中，用水稀释并定容至刻度，临用现配。标准溶液配制
同3.4。
仪器和设备
液相色谱-质谱/质谱仪（LC-MS/MS）：配APCI源。其他同4.2~4.10。
分析步骤
样品前处理
同5.1。
仪器参考条件
液相色谱条件
色谱柱：Cl柱[150mmX4.6mm（内径）X3.0μm（填料粒径）或相当者。柱温：40℃。
流速：0.6mL/min。
进样量：20μL。
流动相：A相：0.1%甲酸水，B相：甲醇，梯度洗脱程序见表4。表4
梯度洗脱程序
时间/min
GB5009.26—2023
质谱/质谱条件
电离模式：大气压化学离子化源（APCI）。检测方式：多反应监测。
电离电压：2.8kV。
接口温度：300℃。
DL温度：200℃。
雾化气流量：3L/min。
离子源温度：280℃。
加热气流量：10L/min。
干燥气流量：10L/min。
监测离子对参数情况见表5。
N-二甲基亚硝胺及其内标的检测离子表5
目标物
NDMA-D（内标物）
19.3标准曲线的制作
定量离子对
75.1/43.1
81.0/46.0
定量离子对碰撞能/eV
定性离子对
75.1/58.1
定性离子对碰撞能/eV
将N-二甲基亚硝胺标准系列工作溶液按浓度由低到高的顺序注入液相色谱-质谱/质谱仪中进样分析，以N-二甲基亚硝胺的质量浓度为横坐标，以N-二甲基亚硝胺及其对应氛代同位素内标的峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线。N-二甲基亚硝胺标准溶液的色谱图参见附录C中图C.1和图C.2。19.4试样溶液的测定
19.4.1定性测定
按照19.2所述条件测定试样和标准使用溶液，试样的质量色谱峰保留时间应与标准物质一致，允许偏差不超过士2.5%，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现且信噪比≥3，而且定性离子对的相对丰度（是用相对于最强离子丰度的强度百分比表示）与浓度相当的标准使用溶液的相对丰度充许偏差不超过表6规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。表6定性时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度
允许的最大偏差
2定量测定
20%~50%（含）
10%~20%（含）
将试样溶液注入液相色谱-质谱/质谱仪中，得到N-二甲基亚硝胺的峰面积与对应同位素内标的峰面积的比值，根据标准曲线得到试样溶液中被测化合物的浓度。样液中N-二甲基亚硝胺的峰面积比值应在标准曲线的线性范围内：如果含量超过标准曲线范围，需调整称样量或定容体积重新检测，若调整定容体积，应调整内标的添加量，使最终定容后内标与标准曲线内标的质量浓度一致。10
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