本标准规定了食品中三氯蔗糖(蔗糖素)的高效液相色谱和高效液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于食品中三氯蔗糖(蔗糖素)的测定。
本标准代替GB 22255-2014《食品安全国家标准 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的测定》。
本标准与GB 22255-2014相比，主要变化如下：
——增加了第二法“高效液相色谱-串联质谱法”；
——修改了高效液相色谱示差检测器法流动相条件；
——修改了高效液相色谱法试样前处理条件；
——修改了高效液相色谱法检出限和定量限。

中华人民共和国国家标准
GB 5009.2982023
食品安全国家标准
食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的测定2023-09-06发布
中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局
2024-03-06实施
GB5009.298—2023
本标准代替GB22255一2014《食品安全国家标准食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的测定》。本标准与GB22255—2014相比，主要变化如下：增加了第二法“高效液相色谱-串联质谱法”；一一修改了高效液相色谱示差检测器法流动相条件；修改了高效液相色谱法试样前处理条件；一修改了高效液相色谱法检出限和定量限。I
1范围
食品安全国家标准
食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的测定GB5009.298—2023
本标准规定了食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的高效液相色谱和高效液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的测定。第一法高效液相色谱法
2原理
试样中的三氯蔗糖用甲醇水提取，除去蛋白、脂肪，经固相萃取柱净化、蒸干复溶富集后，用高效液相色谱仪，反相C，8色谱柱分离，采用示差检测器或蒸发光散射检测器检测，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量。
3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂
甲醇(CHs OH)。
甲醇(CH3 OH):
色谱纯。
正已烷(C：H14)。
磷酸氢二钾(K2 HPO4·3H2O)。
乙酸锌[Zn(CH3COO)2·2H2O]]
亚铁氰化钾[K4 Fe(CN)。·3H2 O]]。乙 酸(CH3 COOH)。
乙腈(CHCN)：色谱纯。
中性氧化铝：粒径75μm~150μm(1003.2试剂配制
目～200目）。
乙酸锌溶液（219g/L)：称取21.9g乙酸锌，加3mL乙酸，加水溶解至100mL。亚铁氰化钾溶液（106g/L)：称取10.6g亚铁氰化钾，加水溶解至100mL。磷酸氢二钾溶液（0.1%）：称取0.1g磷酸氢二钾，加水溶解至100mL。3.2.4
均匀。
甲醇-0.1%磷酸氢二钾溶液（20+80）：将甲醇和0.1%磷酸氢二钾溶液按20：80的体积比混合甲醇-水溶液（75+25）：将甲醇和水按75：25的体积比混合均匀。水-乙睛溶液（89+11）：将水和乙睛按89：11的体积比混合均匀。GB5009.298—2023
3.3标准品
三氯蔗糖标准品(C，2H，9Cl3Og,CAS号：56038-13-2)：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质
证书的标准品。
3.4标准溶液配制
3.4.1三氯蔗糖标准储备溶液（10.0mg/mL)：称取三氯蔗糖标准品0.25g（精确至0.0001g)，用水溶解并转移至25mL容量瓶中，定容至刻度，混匀。储备液置于4℃冰箱中保存，保存期为6个月。3.4.2三氯蔗糖标准中间溶液（1.00mg/mL)：移取5.00mL三氯蔗糖标准储备溶液（10.0mg/mL）于50mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。置于4℃冰箱中保存，保存期为3个月。3.4.3三氯蔗糖标准系列工作溶液：移取适量三氯蔗糖标准中间溶液（1.00mg/mL）用水稀释配制成质量浓度分别为0.0200mg/mL、0.0500mg/mL、0.100mg/mL、0.200mg/mL、0.400mg/mL、0.800mg/mL和1.00mg/mL的标准系列工作溶液。临用现配3.5材料
3.5.1固相萃取柱（柱规格为200mg/6mL,N-）乙烯基吡略烷酮和二乙烯基苯亲水亲脂平衡型填料或等效柱)。免费标准bzxz.net
3.5.20.45μm
仪器和设备
亲水微孔滤膜和0.45μm蔬水微孔滤膜。4.1高效液相色谱仪：配示差检测器或蒸发光散射检测器。4.2天平：感量分别为0.1mg和1mg。4.3涡旋混合器。
4.4水浴锅。
4.5超声波发生器：50kHz。
4.6离心机：转速≥3000r/min。4.7高速离心机：转速≥10000r/min。4.8固相萃取装置。
4.9匀浆机。
4.10粉碎机。
5分析步骤
5.1试样制备
液态样品摇匀；基质均匀的半固态样品和粉状样品直接测定；其他样品需匀浆或粉碎均匀。5.2试样提取
5.2.1酒类试样
5.2.1.1液态酒类试样
称取混匀后酒类试样2g~5g
（精确至0.001g）于蒸发血中，沸水浴上蒸干，残渣用1.00mL水溶解，经0.45um亲水微孔滤膜过滤后，滤液为制备的试样溶液，待测。5.2.1.2含有固体物质酒类试样
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称取混匀后酒类试样2g~5g（精确至0.001g）于蒸发皿中，60℃水浴上加热30min，用10mL水分3次冲洗蒸发皿的残渣，冲洗液合并移至15mL离心管中，涡旋混合器上振荡3min，超声波提取20min,以8500r/min离心5min,5mL水重复提取1次，合并提取液，上清液待净化5.2.2醋、酱油、酱及酱制品类试样5.2.2.1称取混匀后试样2g~5g（精确至0.001g）于50mL离心管，加入1.0g中性氧化铝，加入5mL水，涡旋混合器上振荡3min后，加入15mL甲醇，继续振荡30s，超声波提取20min，以3000r/min离心10min，将上清液移入50mL离心管中。沉淀物加入5.0mL甲醇水溶液（75+25），玻璃棒搅拌均匀后，涡旋混合器上振荡30s，以3000r/min离心10min，重复提取2次，合并上清液。5.2.2.2将全部上清液转移至分液漏斗中，加入30mL正己烷，振摇2min，静置分层20min后，下层水相移至蒸发皿，于沸水浴上蒸发，当蒸发皿中液体在1mL左右时用9mL水分3次冲洗蒸发皿，冲洗液合并移至15mL离心管中，超声波处理5min，以3000r/min离心10min待净化。5.2.3果冻、糖果、蜜饯凉果类试样称取粉碎混匀后试样2g~5g（精确至0.001g）于50mL离心管，加入5mL水，涡旋混合器上振荡3min后，加入15mL甲醇，0.50mL乙酸锌溶液和0.50mL亚铁氰化钾溶液，继续振荡30s，经60℃水浴加热15min，水浴过程中加以振摇分散，以下步骤自5.2.2.1“超声波提取20min，以3000r/min离心10min”开始，到5.2.2.2“超声波处理5min，以3000r/min离心10min待净化”为止依次处理。5.2.4其他试样
称取混匀后试样2g~5g（精确至0.001g)于50mL离心管，加入5mL水，涡旋混合器上振荡3min后，加入15mL甲醇，0.50mL乙酸锌溶液和0.50mL亚铁氰化钾溶液，以下步骤自5.2.2.1“继续振荡30s，超声波提取20min，以3000r/min离心10min”开始，到5.2.2.2超声波处理5min，以3000r/min离心10min待净化”为止依次处理。5.3试样净化
5.3.1示差检测器
固相萃取柱使用前依次用4mL甲醇、4mL水活化，保持柱体湿润。将全部试样提取上清液移入已活化的固相萃取柱，控制液体流速不超过1滴/s，柱上液面为2mm左右时加入1mL水，继续保持液体流速为1滴/s，到柱中液体完全排出后，用3mL甲醇洗脱，收集全部洗脱液，于沸水浴上蒸干，残渣用1.00mL水溶解（如溶液有浑浊现象可将其移入离心管，10000r/min离心5min)，经0.45Hm亲水微孔滤膜过滤，滤液为制备的试样溶液，待测。5.3.2蒸发光散射检测器
固相萃取柱使用前依次用4mL甲醇、4mL水活化，保持柱体湿润。将全部试样提取上清液移入已活化的固相萃取柱，控制液体流速不超过1滴/s，柱上液面为2mm左右时加入1mL水，继续保持液体流速为1滴/s，到柱中液体完全排出后，用3mL甲醇洗脱，收集全部洗脱液，于沸水浴上蒸干，残渣用1.00mL水-乙睛溶液（89+11）溶解（如溶液有浑浊现象可将其移入3
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离心管，10000r/min离心5min)，经0.45μm疏水微孔滤膜过滤，滤液为制备的试样溶液，待测。注：果冻类样品经提取后的上清液需要50℃水浴加热后趁热过柱，否则易堵塞萃取柱。5.4空白试验
不同试样的前处理需要同时做试样空白试验5.5仪器参考条件
5.5.1示差检测器
5.5.1.1色谱柱：C，8(250mm×4.65mm,5μm)或性能相当者
5.5.1.2流动相：甲醇-0.1%磷酸氢二钾溶液（20+80）。5.5.1.3流速：1.0mL/min。
5.5.1.4柱温：35℃。
5.5.1.5检测池温度：35℃。
5.5.1.6灵敏度：16。
5.5.1.7进样量：20μL。
5.5.2蒸发光散射检测器
5.5.2.1色谱柱：Cs(250
5um)或性能相当者。
mmx4.6mm,5
5.5.2.2流动相：A为水，B为乙腈，水+乙腈=89+11。注：当检测样品基质复杂，强保留物质影响后续检测时，可采取梯度洗脱程序，参见附录A，5.5.2.3流速：1.0mL/min。
5.5.2.4柱温：35℃。
5.5.2.5蒸发光散射检测器条件：按不同品牌蒸发光散射检测器在高水相流动相条件下的要求设置。如雾化压力0.137MPa：增益10；蒸发温度60℃。或性能相当者。5.5.2.6进样量：20μL。
5.6标准曲线的制作
5.6.1示差检测器
将三氯蔗糖标准系列工作溶液按仪器参考条件进行测定，得到相应的标准系列工作溶液的色谱峰面积。以标准系列工作溶液质量浓度为横坐标，以峰面积响应值为纵坐标，绘制工作曲线。三氯蔗糖标准溶液的色谱图参见附录B中图B.1。5.6.2蒸发光散射检测器
将三氯蔗糖标准系列工作溶液按仪器参考条件进行测定，得到相应的标准系列工作溶液的色谱峰面积。以标准系列工作溶液质量浓度为横坐标，以峰面积响应值为纵坐标，绘制对数工作曲线。三氯蔗糖标准溶液的色谱图参见图B.2。5.7试样溶液的测定
将试样溶液和空白试样溶液20uL注入液相色谱仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到待测液中三氯蔗糖的质量浓度。
注：试样溶液中三氯蔗糖浓度超过标准曲线线性范围时，稀释后测定。4
6分析结果的表述
试样中三氯蔗糖的含量按式（1)计算。(-po) ×V×1 000
m×1000
式中：
试样中三氯蔗糖的含量，单位为克每千克(g/kg);X
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由标准曲线得到的试样溶液中三氯蔗糖的质量浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；由标准曲线得到的试样空白中三氯蔗糖的质量浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；试样定容的体积，单位为毫升(mL)；1000一一换算系数；
试样质量，单位为克(g);
稀释因子。
结果保留3位有效数字。
精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。8其他
蒸馏酒：取样量为2.000g，定容至1.00mL时，本方法的检出限为0.0075g/kg，定量限为0.02g/kg。其他食品：取样量为2.000g，定容至1.00mL时，本方法的检出限为0.01g/kg，定量限为0.03g/kg。高效液相色谱－串联质谱法
第二法
9原理
试样中的三氯蔗糖用水提取，除去蛋白、脂肪，经固相萃取柱净化，采用高效液相色谱-串联质谱仪检测，外标法定量。
试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。
10.1试剂
甲醇(CH3 OH)。
甲醇(CH3OH)：
色谱纯。
正已烷(CH 4)。
乙酸锌[Zn(CH3 COO)2 -2H2 O]
亚铁氰化钾[K4 Fe(CN)。·3H2O]]。5
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10.2试剂配制
乙酸锌溶液（219g/L)：称取21.9g乙酸锌，加3mL乙酸，加水溶解至100mL。10.2.1
10.2.2亚铁氰化钾溶液（106g/L)：称取10.6g亚铁氰化钾，加水溶解至100mL。10.3标准品
三氯蔗糖(C, 2 H Cl3 Os,CAS
质证书的
标准品。
10.4标准溶液配制
号：56038-13-2）：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物10.4.1三氯蔗糖标准储备溶液（10.0mg/mL)：称取三氯蔗糖标准品0.25g（精确至0.0001g)，用水溶解并转移至25mL容量瓶中，定容至刻度，混匀。储备液置于4℃冰箱中保存，保存期为6个月。10.4.2三氯蔗糖标准中间溶液（10mg/L)：移取10.0μL三氯蔗糖标准储备溶液（10.0mg/mL）于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。置于4℃冰箱中保存，保存期为3个月。10.4.3三氯蔗糖标准系列工作溶液：分别移取三氯蔗糖标准中间溶液（10mg/L)0.100mL、0.200mL、
0.500mL、1.00mL和1.50mL于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。配制成三氯蔗糖质量浓度分别为0.100mg/L、0.200mg/L、0.500mg/L、1.00mg/L和1.50mg/L的标准系列工作溶液。临用现配。
10.5材料
10.5.1固相萃取柱（柱规格为200mg/6mL，N-等效柱)。
10.5.20.22μm
仪器和设备
乙烯基吡咯烷酮和二乙烯基苯亲水亲脂平衡型填料或亲水微孔滤膜和0.22μm疏水微孔滤膜。高效液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源。11.1
11.2天平：感量分别为0.1mg和1mg。11.3涡旋混合器。
11.4水浴锅。
11.5超声波发生器：50kHz。
11.6离心机：转速≥3000r/min。11.7固相萃取装置。
11.8匀浆机。
11.9粉碎机。
分析步骤
试样制备
液态样品摇匀；基质均匀的半固态样品和粉状样品直接测定；其他样品需匀浆或粉碎均匀，12.2试样提取
12.2.1酒类试样
12.2.1.1蒸馏酒
GB5009.298—2023
称取混匀后蒸馏酒试样2g（精确至0.001g）至10mL容量瓶中，用水定容至刻度摇匀，试样经0.22um亲水微孔滤膜过滤，滤液为制备的试样溶液，待测。12.2.1.2发酵酒和配制酒
12.2.1.2.1液态试样：称取混匀后试样2g（精确至0.001g）于蒸发血中，60℃水浴上加热30min，用10mL水分3次冲洗蒸发皿的残渣，冲洗液全部转移至25mL容量瓶中，用水定容至刻度并摇匀，待净化。
12.2.1.2.2含有固体物质酒类试样：称取混匀后酒类试样2g（精确至0.001g）于蒸发皿中，60℃水浴上加热30min，用10mL水分3次冲洗蒸发皿的残渣，冲洗液合并移至15mL离心管中，涡旋混合器上振荡3min，超声波提取20min，以8500r/min离心5min，上清液转移至25mL容量瓶中，10mL水重复提取1次，合并提取液后，用水定容至刻度并摇匀，待净化。12.2.2果冻、糖果、蜜饯凉果类试样称取2g试样（精确至0.001g）于50mL离心管中，加入10mL水，涡旋混合器上振荡3min，加入1.00mL乙酸锌溶液、1.00mL亚铁氰化钾溶液，经60℃水浴加热15min，水浴过程中注意摇散。超声波提取20min,8500r/min离心5min，取上清液（必要时可用快速定量滤纸过滤）于25mL容量瓶中，10mL水重复提取1次，合并提取液后，加水定容至刻度，混匀后转移至50mL离心管，加入15mL正已烷，涡旋混合器上振荡3min,8500r/min离心5min，弃去上层正已烷层，下层清液待净化。12.2.3其他试样
称取2g试样（精确至0.001g）于50mL离心管中，加入10mL水，涡旋混合器上振荡3min，加入1.00mL乙酸锌溶液和1.00mL亚铁氰化钾溶液，超声波提取20min,8500r/min离心5min，取上清液（必要时可用快速定量滤纸过滤）于25mL容量瓶中，10mL水重复提取1次，合并提取液后，加水定容至刻度，混匀后转移至50mL离心管，加入15mL正已烷，涡旋混合器上振荡3min，8500r/min离心5min，弃去上层正已烷层，下层清液待净化。12.3试样净化
固相萃取柱使用前依次用4mL甲醇、4mL水活化，保持柱体湿润。准确移取10.00mL试样提取液加入已活化的固相萃取柱，控制液体流速不超过1滴/s，待柱中液体完全排出后，用3mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液于10mL容量瓶中，加水定容，混匀，经0.22μm疏水微孔滤膜过滤后，滤液为制备的试样溶液，待测。注：果冻类样品待净化液需要50℃水浴加热后趁热过柱，否则易堵塞萃取柱12.4空白试验
不同试样的前处理需要同时做试样空白试验。
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