本标准规定了含乳酸菌食品中的乳酸菌的检验方法。 本标准适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验。
本标准代替GB 4789.35-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 商业无菌检验》。
本标准与GB 4789.35-2016相比，主要变化如下：
——增加了实时荧光PCR方法为选做方法；
——修改了乳酸菌的定义、样品制备、培养时间；
——修改了嗜热链球菌和乳杆菌计数方法的描述；
——修改了部分培养基成分、储备液浓度和制备方法。

中华人民共和国国家标准
GB4789.352023
食品安全国家标准
食品微生物学检验
2023-09-06发布
乳酸菌检验
2024-03-06实施
中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局
本标准代替GB4789.35—2016食品安全国家标准食品微生物学检验
本标准与GB4789.352016相比·主要变化如下：增加了实时荧光PCR方法为选做方法：修改了乳酸菌的定义、样品制备、培养时间；修改了嗜热链球菌和乳杆菌计数方法的描述：一修改了部分培养基成分、储备液浓度和制备方法GB4789.35—2023
乳酸菌检验》。
1范围
食品安全国家标准
食品微生物学检验
乳酸菌检验
本标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌（lacticacidbacteria）的检验方法。本标准适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验。术语和定义
2.1乳酸菌lacticacidbacteria
GB4789.35—2023
一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称，不能液化明胶、不产生吲哚、革兰氏阳性、无运动无芽孢、触酶阴性、硝酸还原酶阴性及细胞色素氧化酶阴性反应的细菌。本标准中乳酸菌主要为乳杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）和嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus）3
设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下恒温培养箱：36℃士1℃。
厌氧培养装置：厌氧培养箱、厌氧罐、厌氧袋或能提供同等厌氧效果的装置。冰箱：2℃~8℃。
均质器及无菌均质袋，均质杯或灭菌乳钵涡旋混匀仪。
电子天平：感量0.001g。
实时定量PCR仪
恒温水浴锅或金属浴。
离心机：离心力>10000×g。
无菌试管：18mm×180mm.15mmX100mm。无菌吸管：lmL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）。微量移液器和灭菌吸头：2mL、10μL、100μL、200L、1000L无菌锥形瓶：500mL、250ml
无菌平：直径90mm
PCR管。
培养基和试剂
稀释液：见附录A中A.1。
MRS(ManRogosaSharpe)琼脂培养基：见附录A中A.2莫匹罗星锂盐（Li-Mupirocin）和半胱氨酸盐酸盐（CysteineHydrochloride）改良MRS琼脂培养1
GB4789.35—2023
基：见附录A中A.3。
MC（ModifiedChalmers）琼脂培养基：见附录A中A.4。0.5%蔗糖发酵管：见附录A中A.5.0.5%纤维二糖发酵管：见附录A中A.5。0.5%麦芽糖发醇酵管：见附录A中A5。0.5%甘露醇发醇管：见附录A中A.5。0.5%水杨苷发酵管：见附录A中A.5。0.5%山梨醇发酵管：见附录A中A.50.5%乳糖发酵管：见附录A中A.5.七叶苷发酵管：见附录A中A6。
革兰氏染色液：见附录A中A.7
生理盐水：见附录A中A.8
DNA提取液：见附录A中A.9。
10XPCR缓冲液见附录A中A.10
莫匹罗星锂盐（C2HO·Li）：化学纯半胱氨酸盐酸盐（C.HCINO,S)：纯度>99%。dNTPs
TaqDNA聚合酶：5U/μl
七种乳酸菌引物探针。
灭菌去离子水。
检验程序
乳酸菌检验程序见图1。
乳酸菌总数
的计数培养
条件及结果
说明见
乳酸菌总数计数
操作步骤
样品制备
样品25g(mL）+225mL稀释液
10倍系列稀释
选择2个~3个适宜矫释度
各取1mL加入到无菌平照内，
每个平至加入15mL~20ml
莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐
酸盐改良MRS球脂培养基
36℃±1℃
48h~72h
双歧杆菌计数
选择2个～3个适宜释释
度，各取1mL加入到无
菌平血内，每个平血加入
15mL~20mLMRS琼脂
培养基
36±I℃
48h~72h
乳杆菌计数
菌种鉴定
（可选做）
乳酸菌检验程序图
样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。稀释液在试验前应在36℃土1℃条件下充分预热15min~30minGB4789.35—2023
选择2个~3个适宜稀
释度，各取1mL加入
到无菌平蓝内，每个平
m加入15mL~20ml
MC琼脂培养基
36℃±1℃
48h~72h
曙热链球南计数
6.1.3冷冻样品可先使其在2℃~5℃条件下解冻，时间不超过18h，也可在温度不超过45℃的条件下解冻，时间不超过15min。
6.1.4固体和半固体样品：以无菌操作称取25g样品，置于装有225mL稀释液的无菌均质杯内，于8000×g~10000×g均质1min~2min，制成1：10样品匀液：或置于225mL稀释液的无菌均质袋中.用拍击式均质器拍打1min~2min制成1：10的样品匀液。6.1.5液体样品：液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25mL放人装有225mL稀释液的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）或均质袋中，充分振摇或拍击式均质器拍打1min~2min，制成1：10的样品匀液。
6.1.6经特殊技术（如包埋技术）处理的含乳酸菌食品样品应在相应技术/工艺要求下进行有效前处理。Www.bzxZ.net
GB4789.35—2023
6.2稀释及培养
6.2.1用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1*10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于装有9ml稀释液的无菌试管中（注意吸管或微量移液器吸头尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100的样品匀液6.2.2另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头经特殊技术（如包埋技术）处理的含乳酸菌食品应按照相应技术/工艺要求进行稀释6.2.3
6.3乳酸菌计数
乳酸菌总数
乳酸菌总数计数培养条件的选择及结果说明见表1。表1
乳酸菌总数计数培养条件的选择及结果说明样品中所包括乳酸菌类别
仅包括双歧杆菌属
仅包括乳杆菌属
仅包括嗜热链球菌
同时包括双歧杆菌属和乳杆菌属同时包括双歧杆菌属和曙热链球菌同时包括乳杆菌属和嗜热链球菌同时包括双歧杆菌属、
乳杆菌属和嗜热链球菌
双歧杆菌计数
培养条件的选择及结果说明
按GB4789.34的规定执行
按照6.3.4操作，厌氧培养，结果即为乳杆菌属总数按照6.3.3操作，结果印为嗜热链球菌数1
按照6.3.4操作，结果即为乳敢菌总数：如需单独计数双歧杆菌属数目·按照6.3.2操作按照6.3.2和6.3.3操作，二者结果之和即为乳酸菌总数：如需单独计数双歧杆菌属数目·按照6.3.2操作按照6.3.3和6.3.4操作，二者结果之和印为乳胶菌总数：6.3.3结果为嗒热链球菌总数：
6.3.4结果为乳杆菌属总数
按照6.3.3和6.3.4操作，二者结果之和即为乳酸菌总数：如需单独计数双歧杆菌属数目，按照6.3.2操作根据对待检样品双歧杆菌含量的估计选择2个一3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1mL样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移人平皿后，将冷却至48℃～50℃的莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良MRS琼脂培养基倾注入平Ⅲ15mL~20mL.转动平Ⅲ使混合均匀。培养基凝固后倒置于36℃士1℃庆氧培养，根据双歧杆菌生长特性，一般选择培养48h.若菌落无生长或生长较小可选择培养至72h，培养后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板倾注要求在15min内完成。
曙热链球菌计数
根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1mL样品匀液于灭菌平Ⅲ内，每个稀释度做两个平Ⅲ。稀释液移人平后，将冷却至48℃～50℃的MC琼脂培养基及时倾注人平Ⅲ皿15mL~20mL.转动平Ⅲ使混合均匀培养基凝固后倒置于36℃土GB4789.35—2023
1℃有氧培养，根据嗜热链球菌生长特性，一般选择培养48h，若菌落无生长或生长较小可选择培养至72h。嗜热链球菌在MC琼脂培养基平板上的菌落特征为：菌落中等偏小，边缘整齐光滑的红色菌落，直径2mm土1mm，菌落背面为粉红色6.3.4乳杆菌计数
根据待检样品活菌总数的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1mL样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿：稀释液移人平皿后，将冷却至48℃~50℃的MRS琼脂培养基倾注人平Ⅲ15mL～20mL，转动平Ⅲ使混合均匀。培养基凝固后倒置于36℃士1℃厌氧培养，根据乳杆菌生长特性，一般选择培养48h，若菌落无生长或生长较小可选择培养至72h。从样品稀释到平板倾注要求在15min内完成。
6.4菌落计数
见GB4789.2菌落计数部分。
6.5结果的表述
见GB4789.2计算方法部分。
菌落数的报告
见GB4789.2菌落总数的报告部分7
结果与报告
根据菌落计数结果出具报告，报告单位以CFU/g（mL）表示。乳酸菌的鉴定（可选做）
专生化鉴定
8.1第一法
8.1.1纯培养
挑取3个或以上单菌落，嗜热链球菌接种于MC琼脂平板置36℃士1℃有氧培养48h，乳杆菌属接种于MRS琼脂平板.置36℃士1℃厌氧培养48h。8.1.2双歧杆菌的鉴定
按GB4789.34的规定操作。
8.1.3涂片镜检
嗜热链球菌菌体镜下呈球形或球杆状.直径为0.5um~2.0μm，成对或成链排列，无芽孢，革兰氏染色阳性。乳杆菌属镜下菌体形态多样，呈长杆状、弯曲杆状或短杆状，无芽孢，革兰氏染色阳性8.1.4乳酸菌菌种主要生化反应
乳酸菌菌种主要生化反应见表2和表3。5
GB4789.35—2023
干酪乳杆菌(Leaser）
鼠李糖乳杆菌
(L..rhamnosus)
德氏乳杆菌保加利亚种
(L.delbrueckii subsp.bulgaricus)嗜酸乳杆菌
(L.acidophilus)
罗伊氏乳杆菌
.reteri)
植物乳杆菌
(L.plamarum)
常见乳杆菌属内种的主要生化反应表2
七叶苷
纤维二糖
麦芽糖
甘露醇
水杨苷
山梨醇
注：+表示90%以上菌株阳性：一表示90%以上菌株阴性：d表示11%~89%菌株阳性：ND表示未测定表3
略热链球菌（S.thermophilus）菊糖
嗜热链球菌的主要生化反应
甘露醇
注：十表示90%以上菌株阳性：一表示90%以上菌株阴性。8.2
第二法
实时荧光PCR法鉴定
纯培养
同8.1,1，
DNA模板制备
水杨苷
山梨醇
鸡尿酸
棉籽糖
七叶昔
使用接种环刮取MC琼脂平板或MRS琼脂平板上的菌落2个～10个，悬浮于200L灭菌生理盐水中，充分混匀，10000×g~12000×g离心3min，弃去上清。加入50LDNA提取液涡旋混匀，置于100水浴或者金属浴中10min后迅速冷却.10000×g~12000×g离心3min。吸取上清液至新的PCR反应管内，作为DNA模板使用。提取后的DNA模板应置于4℃供当天使用，否则应于一20℃以下保存，并于1周内使用。
注：根据实验室实际情况，也可用商品化试剂盒制备DNA模板。8.2.3PCR反应体系
总反应体系体积为25L：10×PCR缓冲液2.5L上下游引物（10umol/L）各1uL、探针（10μmol/L)0.5μL、dNTPs（2.5μmol/L)3μL，TaqDNA聚合酶（5U/uL)0.5μL、模板DNA1μL、灭菌去离子水补足至25L。每个反应均应设置至少2个平行。注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整，亦可选用含有PCR缓冲液。MgCledNTP和Tag酶等成分基于Tagman探针的实时荧光PCR预混液6
PCR反应条件
GB4789.35—2023
50℃5min，95℃预变性3min.94℃变性5s.60退火延伸40s（同时收集FAM荧光），进行40个循环。
注：PCR反应参数可根据基因扩增仪型号实时荧光PCR反应体系进行适当调整鉴定用引物和探针序列见表4
干酪乳杆菌(L.casei)
德氏乳杆菌保加利亚亚种
(.delbruecki subsp.bulgaricus)嗜酸乳杆菌（L.acidophilus）
罗伊氏乳杆菌（L.reuteri）
鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus）
植物乳杆菌（L.plantarum）
哈热链球菌（S.thermophilus）8.2.5
对照设置
常见乳酸菌实时荧光PCR检测引物和探针序列引物序列
5'-GCCGGGATCTTCAACTCAAC3
5'-GGACGGCGCAGAAATCTATC-3
5'-ACTTTAGCCCATACCTGCGT-3
5'-GTAAATTCCAAGCCGCCCTT-3\
5'-GAGCTGAACCAACAGATTCAC-3
5'-GCAGGTTCCCCACGTGTTAC-3'
5'-CTTTCGCAGCCTGATAGTGG-3'
5'-TCCGAAGAGCCTGAGACATC-3
5'-GGTTGATTCAGTGGCAGCTC-3
5'-GTGTGCATCACCCATGTCC-3'
5'-AGCTTGAAAGATGGCTTCGG-3
5-GGTCGGCTACGTATCATTGC-3'
5GCCTGATTCTGGTGAGCAAG-3\
5'-CCGCAACTGAGTCAACAACA-3
探针序列
5-FAM-TCGCCCAATGCAGCCT
GCGC-TAMRA-3'
5'-FAM-CCGGTTGCCCGTTTC
CTGCGG-TAMRA-3\
5'-FAM-CCCATCCGC-
CGCTAGCGTT-TAMRA-3
5'-FAM-CGGTTGCAGCATTAGT
TCCTCGTGCTAMRA-3
5'-FAM-TCAATTTCTGCGCGCG-
GTACCA-TAMRA-3'
5'-FAM-ACGCCGCGGGACCATC
CAAA-TAMRA-3'
5'-FAMTCCACTGCACCAGAGT
CAATCAGCT-TAMRA-3\
检测过程（包括DNA提取）中，每个反应均应设置阳性对照、阴性对照和空白对照。其中阳性对照模板为扩增片段的阳性克隆分子DNA或阳性菌株DNA.阴性对照模板为非乳酸菌菌株DNA，空白对照模板为无菌水。
结果判读
对照的结果判读
阳性对照出现典型扩增曲线，Ct≤30：阴性对照无典型扩增曲线或Ct≥40：空白对照无典型扩增曲线或Ct≥40。否则，结果视为无效。8.2.6.2
样品的结果判读
当样品检测Ct≥40时，判定样品结果为某种乳酸菌阴性：当检测Ct≤35，可判定该样品结果为某种乳酸菌阳性：当检测35A.1稀释液
A.1.1成分
胰蛋白陈
A,1.2制法
附录A
培养基及试剂
将上述成分加人到1000mL蒸馏水中.加热溶解，分装后121高压灭菌15min。MRS琼脂培养基
A.2.1成分
蛋白陈
牛肉浸粉
酵母浸粉
葡萄糖
吐温80
KHPO·7H.O
醋酸钠·3H.0
柠檬酸三铵
MnSO,·4HO
琼脂粉
2制法
将上述成分加人到1000mL蒸馏水中.加热溶解，调节pH至6.2土0.2.分装后121℃高压灭菌15min。
莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良MRS琼脂培养基A.3.1莫匹罗星锂盐储备液制备：称取50mg莫匹罗星锂盐加人到5ml蒸馏水中，用0.22μum微孔滤膜过滤除菌，临用现配。
A.3.2半胱氨酸盐酸盐储备液制备：称取500mg半胱氨酸盐酸盐加人到10mL蒸馅水中，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，临用现配。A.3.3
3制法
将A.2.1成分加人到985mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH至6.2士0.2，分装后121℃高压灭菌15min。临用时加热熔化琼脂，在水浴中冷至48℃~50℃.用无菌注射器将莫匹罗星锂盐储备液及半胱氨酸盐酸盐储备液制备加人到熔化琼脂中，使培养基中莫匹罗星锂盐的浓度为50μg/mL，半胱氨酸盐酸盐的浓度为500ug/ml
MC琼脂培养基
大豆蛋白陈
牛肉浸粉
酵母浸粉
葡萄糖
碳酸钙
蒸馏水
1%中性红溶液
1000mL
GB4789.35—2023
将前面7种成分加人蒸馏水中，加热溶解，调节pH至6.0士0.2.加人中性红溶液。分装后121℃高压灭菌15min。
乳杆菌糖发酵管
牛肉浸粉
蛋白陈
酵母浸粉
吐温80
1.6%溴甲酚紫酒精溶液
蒸馏水
A.5.2制法
1000ml
按0.5%加人所需糖类，并分装小试管，121℃高压灭菌15min。A.6
七叶苷发酵管
蛋白陈
磷酸氢二钾
七叶苷
枸橡酸铁
1.6%漠甲酚紫酒精溶液
蒸馏水
将上述成分加人蒸馏水中，加热溶解，121℃高压灭菌15min。e
GB4789.352023
A.7革兰氏染色液
结晶紫染色液
结晶紫
95%乙醇
1%草酸铵水溶液
A.7.1.2制法
将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A.7.2
革兰氏碘液
碘化钾
蒸馏水
将碘与碘化钾先进行混合，加人蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。A.7.3
沙黄复染液
A.7.3.1成分
95%乙醇
蒸馏水
将沙黄溶解于乙醇中.然后用蒸馏水稀释A.7.4
染色法
将涂片在酒精灯火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min.水洗滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。滴加95%乙醇脱色15s~30S直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗，滴加复染液，复染1min。水洗、待干、镜检。生理盐水
2制法
将上述成分加人到1000mL蒸馏水中，加热溶解，分装后121℃高压灭菌15min，10
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