本标准规定了动物性水产品及其制品中广州管圆线虫幼虫的形态学和PCR检验方法。 本标准适用于动物性水产品及其制品中广州管圆线虫幼虫的检验。

中华人民共和国国家标准
GB31610.32023
食品安全国家标准
动物性水产品及其制品中
广州管圆线虫的检验
2023-09-06发布
中华人民共和国国家卫生健康委员会2024-03-06实施
国家市场监督管理总局
1范围
食品安全国家标准
动物性水产品及其制品中
广州管圆线虫的检验
31610.32023
本标准规定了动物性水产品及其制品中广州管圆线虫(Angiostrongyluscantonensis)幼虫的形态学和PCR检验方法。
本标准适用于动物性水产品及其制品中广州管圆线虫幼虫的检验。2原理
动物性水产品及其制品中的广州管圆线虫幼虫主要寄生于福寿螺等水产品的肌肉等组织内。解部分离或使用胃蛋白消化动物性水产品及其制品的肌肉等组织获得虫体，根据幼虫的形态特征，初步判断幼虫种类：通过扩增广州管圆线虫核糖体DNA的内转录间隔区(ITS）基因片段并测序，进行广州管圆线虫幼虫的鉴定。
3仪器和设备
3.1生物显微镜：100×~400×。3.2体视显微镜：7.5×~150×。3.3PCR扩增仪。
3.4凝胶成像系统。
3.5电泳仪。
3.6恒温培养箱：37℃土1℃。
3.7高速离心机：转速≥12000r/min。3.8网筛：孔径0.15mm（100目）。3.9锥形量杯：1000mL。
3.10微量移液器：0.2μL～2.5μL1uL~10uL、10μL~100μL、100μL~1000μL。4
试剂和材料
4.1试剂
4.1.1盐酸：36%~38%HCI溶液。
4.1.2生理盐水：0.85%NaC1溶液。Tris-HCI溶液(pH8.0)。bzxz.net
4.1.40.5mol/L
4.1.510%SDS
4.1.65mol/L
EDTA溶液(pH
【8.0]。
溶液。
NaCI溶液。
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4.1.73000U/mg胃蛋白酶。
mg/mL蛋白酶K。
4.1.9苯酚/三氯甲烷/异戊醇（25:24:1）4.1.10三氯甲烷。
4.1.115U/uL
4.1.1210xPCR
耐热DNA聚合酶。
缓冲液。
4.1.1325mmol/LMgCl2。
4.1.14dNTPs:dATP、dTTP、dCTP、dGTP每种浓度为2.5mmol/L。4.1.15琼脂糖：电泳级。
4.1.1650xTAE
4.1.171×TE
电泳缓冲液，使用前用去离子水稀释成1XTAE缓冲液。溶液(pH8.0)。
mg/mL溴化乙锭(EB)或其他核酸染料。4.1.196×上样缓冲液。
4.1.20100bp~2000bpDNA分子量标准。4.1.21引物：浓度为10μmol/L。正向引物F1674:5-GTCGTAACAAGGTATCTGTAGGTG-3反向引物58SR4：5-TAGCTGCGTTTTTCATCGATA-3扩增广州管圆线虫ITS基因片段长度为827bp。4.2试剂配制
4.2.1生理盐水：称取8.5gNaCI溶解于900mL去离子水，加去离子水至1000mL。4.2.21mol/L
Tris-HCI溶液：称取121.1gTris(三羟甲基氨基甲烷)溶解于800mL去离子水，用盐酸调节pH至8.0,加去离子水至1000mL。4.2.30.5mol/L
EDTA溶液：称取186.1g
Na2EDTA-2H2O（二水合乙二胺四乙酸二钠）溶800mL去离子水，搅拌溶解，用NaOH调节pH至8.0,加去离子水至1000mL。4.2.45mol/LNaCI溶液：称取292.5gNaCl溶解于900mL去离子水，加去离子水至1000mL。4.2.5胃蛋白酶消化液：取胃蛋白酶5g，溶解于900mL生理盐水中，加盐酸7mL，混匀，再加生理盐水至1000mL，临用现配。
4.2.6裂解液：10%SDS溶液100mL、1mol/LTris-HCI溶液10mL、0.5mol/LEDTA溶液200mL、5mol/LNaCI溶液20mL，加灭菌去离子水至1000mL。4.2.71.5%琼脂糖凝胶：琼脂糖1.5g，加入1XTAE缓冲液至100mL，加热至完全融化后冷却至60℃~70℃，加入10mg/mL溴化乙锭5L，混匀，制备凝胶。5检测方法
5.1形态学方法
5.1.1肺囊检查法
5.1.1.1样品制备
解部受检的螺类，敲除外壳，沿外套膜的左侧至后侧基部剪开铺平，再剪开肺囊袋。5.1.1.2镜检
体视显微镜观察幼虫结节。广州管圆线虫幼虫在肺囊上虫体卷曲，形成凸起状结节。轻轻剥开结2
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节，生物显微镜观察幼虫。广州管圆线虫第三期幼虫白色透明，其模式图见图A.1，其实物图见图A.2，长度为0.4mm~0.5mm，虫体头端钝圆，尾部末端尖细，体表有微细环状横纹（见附录A）。在螺类中检查到具备上述特征的虫体，可判断为疑似广州管圆线虫幼虫。虫体立即用于DNA提取或-20℃保存备用。
注：未检出凝似广州管圆线虫的样品需用胃蛋白酶消化法进行检测。5.1.2胃蛋白酶消化法
5.1.2.1取样
取动物性水产品或其制品的肌肉等组织用剪刀剪成小块，或用均质器低速搅碎。5.1.2.2消化
取5.1.2.1样品200g，按照样品与胃蛋白酶消化液1:5的质量体积比混匀，37℃土1℃恒温培养箱放置4h~16h,使肌肉完全消化。可根据不同水产品种类以及消化时间对胃蛋白酶浓度和使用量进行调整。
5.1.2.3过滤
消化后的悬液用网筛过滤，并用生理盐水冲洗网筛上的残留物。收集滤液置于锥形量杯内，沉淀15min~30min。轻轻倾去上清液，加入适量的生理盐水，搅拌后再沉淀15min~30min。重复洗涤3次~5次，至上清液透明为止，沉淀备用。5.1.2.4镜检
全部沉淀分次转移至玻璃平皿，在体视显微镜下收集沉淀中的虫体，用生物显微镜进行形态鉴定。具备5.1.1.2特征的虫体，可判断为疑似广州管圆线虫幼虫。虫体立即用于DNA提取或-20℃保存备用。
5.2PCR方法
5.2.1DNA提取
取5.1.1.2或5.1.2.4分离出的虫体，放入1.5mL离心管中，加裂解液500μL，加入蛋白酶K10μL,55℃水浴至虫体被完全消化（1h~3h）。在混合液中加入苯酚/三氯甲烷/异戊醇（25:24:1）500μL，混匀，4℃12000r/min离心5min。取上层水相，加入等体积的三氯甲烷，混匀，4℃12000r/min离心5min。取上层水相加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，充分混匀，放置1h，4℃12000r/min离
心15min。倾去上清液，加入75%乙醇700L冲洗沉淀，4℃12000r/min离心5min，弃上清液，干燥后加入20μL1×TE溶液溶解DNA，立即检测或-20℃保存备用。注：根据实验室实际情况，可使用经验证的商品化组织DNA提取试剂盒提取DNA。5.2.2PCR反应体系
在PCR管中依次加入10×PCR缓冲液5.0μL、MgCl25.0μL、dNTPs2.0μL、正向引物和反向引物各2.0μL、耐热DNA聚合酶0.5uL、DNA模板2.5L加灭菌去离子水至总体积50μL。每次试验需设阳性、阴性和空白对照。阳性对照用广州管圆线虫DNA或含有目标基因序列的质控品，阴性对照用不含虫体的动物性水产品DNA做模板，空白对照用灭菌去离子水做模板。5.2.3PCR反应条件
94℃预变性5min;94℃变性30s65℃退火3Os,72℃延伸1min，扩增35个循环；72℃延伸3
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min，4℃保存。
5.2.4电泳
取PCR扩增产物10μL与6×上样缓冲液2.0μL混合，加样于1.5%琼脂糖凝胶中，其中一孔加入DNA分子量标准。1X×TAE电泳缓冲液，5V/cm恒压电泳30min~40min,用凝胶成像系统观察
和记录结果。
5.2.5PCR结果判定
阳性对照出现预期大小的条带（827bp)，阴性对照和空白对照无条带，待测样品扩增出预期大小的条带，可判定PCR结果为阳性：无扩增条带或未扩增出预期大小的条带均判为PCR结果为阴性取PCR结果为阳性的PCR产物进行基因序列双向测序，将测序结果与广州管圆线虫参考序列（见附录B)进行同源性比对。
6结果报告
6.1形态学方法检出疑似幼虫、PCR结果为阳性且扩增片段基因序列与广州管圆线虫参考序列同源性≥95%，报告检出广州管圆线虫。6.2形态学方法未检出幼虫、或PCR结果为阴性、或扩增片段基因序列与广州管圆线虫参考序列同源性<95%，报告未检出广州管圆线虫。4
附录A
广州管圆线虫第三期幼虫形态
A.1广州管圆线虫第三期幼虫模式图见图A.1。排泄孔
生殖原基
一肛门
图A.1广州管圆线虫第三期幼虫模式图（仿诸欣平等2019）2广州管圆线虫第三期幼虫实物图见图A.2。A.2
200μm
图A.2广州管圆线虫第三期幼虫实物图GB31610.32023
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附录B
广州管圆线虫参考序列
GTCGTAACAAGGTATCTGTAGGTGAACCTGCAGATGGATCATCGCTAATCTCACAACCACCACAAAACACAAACAACTAGCATCATCTACGTCGTCGTTACGATCGATGATGTAGTGGTGGGTGGGTGGTTGATGATGAGAGAATGTGATCAACAACGAGAAACCACCAACACATATACACGTTCACCTAGTGTATGATGGTGATGATAATTTGGCGGCTATGTCGCTAAAGTTGGTGGTATCGTCGTATAACACCGTTAGAGCTCAACACACAAGGTGTCTACATGTATAAGCATGAGTCGTTCTAGAGTGACGGTTATGATTGCTTATACGAGCGAAAGCACACACACACACAAACTGTCGCGCATGTATGAATTAATGGTGCGGCGATTTGCTTCGTGATTGTGTGGTGAAGACTTAATGAGCATTGCATGAATGCCACCTTGAATTGCTGGATATGGTTGATAGTGCGTGTATGCATGTGTGTGCACGTTTTGCGTTGTTGGTGATTATGCATGAGATGTAGCTATGCGTAATATACGGCGTATGTCACTCGTTGTCTTTCATGGATGGCGAACTGATAGTATCATCGCATATCTACTATACGCATGTGACACCTGATTGACAGGAAATCTTAATGACCCAAGTATAATGTTTCAATGGGCGCCAACGTAGCAACAGAACAGTTTTTCTACACGTGAAAATGTGGAACGAGATACACAGGATGTATATATATATATATACACATATATATATGTGTATGGAAATTGATATACTAGCTTCAGCGATGGATCGGTCGATTCGCGTATCGATGAAAAACGCAGCTA
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