本标准规定了动物性水产品及其制品中并殖吸虫囊蚴的形态学和PCR检验方法。 本标准适用于动物性水产品及其制品中并殖吸虫囊蚴的检验。

中华人民共和国国家标准
GB31610.5—2023
食品安全国家标准
动物性水产品及其制品中并殖吸虫的检验2023-09-06发布
中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局
2024-03-06实施
1范围
食品安全国家标准
动物性水产品及其制品中并殖吸虫的检验GB31610.5—2023
本标准规定了动物性水产品及其制品中并殖吸虫（Paragonimus）囊的形态学和PCR的检验方法。
本标准适用于动物性水产品及其制品中并殖吸虫囊蝴的检验2原理
动物性水产品及其制品中并殖吸虫的囊蝴主要寄生在蟹类、剃和沼虾等甲壳动物的肌肉组织内。捣碎沉淀分离或揭碎后便用胃蛋白酶消化动物宿主组织获得囊劲，根据并殖吸虫囊的形态特征，初步判断囊蚜的种类通过扩增并殖吸虫核糖体DNA的第二内转录间隔区（ITS2)基因片段并测序，进行并殖吸虫囊呦的鉴定。
仪器与设备
生物显微镜：100×~400×。
体视显微镜：7.5×~150×
PCR扩增仪。
凝胶成像系统。
电泳仪。
恒温培养箱：37℃士1℃。
高速离心机：转速≥12000r/min。网筛：孔径2mm（10目）：孔径0.425mm（40目）。微量移液器：0.2l~2.5μl1L~10μL、10μL~100μL、100L~1000μL锥形量杯：1000ml。
玻璃珠：425μm~600μm。
陶瓷研钵（直径16cm）和研磨棒回旋振荡器。
试剂和材料
盐酸：36%~38%HCI溶液
生理盐水：0.85%NaCI溶液
1mol/LTris-HCI溶液（pH8.0)。4.1.4
0.5mol/LEDTA溶液（pH8.0)。
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10%SDS溶液。
5mol/LNaCI溶液
3000U/mg胃蛋白酶。
20mg/mL蛋白酶K
苯酚/三氯甲烷/异戊醇（25：24：1）。5U/μL耐热DNA聚合酶。
10XPCR缓冲液。
25mmol/LMgCl
dNTPs:dATP、dTTP、dCTP、dGTP.每种浓度为2.5mmol/L。琼脂糖：电泳级。
50×TAE缓冲液，使用前用去离子水稀释成1XTAE缓冲液1XTE溶液（pH8.0)
10mg/mL溴化乙锭（EB）或其他核酸染料。6×上样缓冲液。
100bp~2.000bpDNA分子量标准。引物：浓度为10umol/L。
正向引物3S：5-GGTACCGGTGGATCACTCGGCTCGTG-3反向引物A28：5-GGGATCCTGGTTAGTTTCTTTTCCTCCGC-3扩增的并殖吸虫ITS2基因片段长度为520bp。4.2
试剂配制
4.2.1生理盐水：称取8.5gNaCI溶解于900mL去离子水，再加去离子水至1000mL。4.2.21mol/LTris-HCl溶液：称取121.1gTris（三羟甲基氨基甲烷）溶解于800ml去离子水，用盐酸调节pH至8.0.加去离子水至1000mL0.5mol/LEDTA溶液：称取186.1gNaEDTA2H.O（二水合乙二胺四乙酸二钠）溶解于4.2.3
800mL去离子水，搅拌溶解，用Na0H调节pH至8.0，加去离子水至1000mL。4.2.45mol/LNaCI溶液：称取292.5gNaCI溶解于900mL去离子水，再加去离子水至1000mL。4.2.5胃蛋白酶消化液：取胃蛋白酶5g?溶解于900mL生理盐水中，加盐酸7mL.混匀，再加生理盐水至1000mL.临用现配。
裂解液：10%SDS溶液100mL1mol/LTris-HCl溶液10mL、0.5mol/LEDTA溶液200mL、5mol/LNaCl溶液20ml.加灭菌去离子水至1.000mL4.2.71.5%琼脂糖凝胶：琼脂糖1.5g，加人1×TAE缓冲液至100mL，加热至完全融化后冷却至60℃~70℃，加人10mg/mL溴化乙锭5L，混匀.制备凝胶。检测方法
形态学方法
5.1.1捣碎法
样品制备
当送检的甲壳类水产品或其制品的数量较少时，对单个样品1只（个）分别检测，使用消毒过的陶瓷研钵及研磨棒捣碎样品，用生理盐水冲洗10目网筛过滤于锥形量筒内，除去粗的蟹（站、虾）壳。滤液再用40目网筛过滤·除去细壳，加生理盐水至锥形量杯的最大刻度处·沉淀15min后·弃上清液·用生2
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理盐水洗涤沉淀3次～5次至上清液透明为止，全部沉渣吸入玻璃平Ⅲ.在体视显微镜下收集囊。5.1.1.2镜检
将含有沉渣的玻璃平Ⅲ在体视显微镜下观察·检查挑取其中的囊蚜，在生物显微镜下进行形态鉴定。新鲜水产品中并殖吸虫囊蚜一般呈圆球形或椭圆球形，囊蚜直径250um~435μm，壁厚8m~20um，通常具有2层壁膜，后尾蜘折叠曲在囊内能看见充满黑色颗粒的排泄囊和两侧弯曲的肠管。不同种的并殖吸虫囊大小有差异，如卫氏并殖吸虫囊蜘直径250μm~390m，壁厚14um~20m，有两层囊壁，外薄内厚，后尾劾挤缩囊内·排泄囊稍大：斯氏并殖吸虫囊，直径400m~420um，壁厚12um~14um.内层囊壁略薄，后尾蝴挤缩囊内，排泄囊小而黑：三平正并殖吸虫囊直径415μm~435um，壁厚8μm~12um，内壁层厚，近两端更显增厚，蜘体多作内壁形曲于囊内.其模式图见图A.1其实物图见图A.2。在水产品中检查到具备上述特征的囊蛎，可判定为是似并殖吸虫囊蝴。疑似并殖吸虫囊蝴立即用于DNA提取或一20C保存备用。5.1.2胃蛋白酶消化法
5.1.2.1取样
当送检的甲壳类水产品或其制品数量大于20个以上，可使用胃蛋白酶消化法。分批用研磨棒在消毒过的陶瓷研钵中将样品捣碎，备用5.1.2.2消化
取5.1.2.1样品200g或者按样品称重后的实际重量，分批按照样品与胃蛋白酶消化液1：5的质量体积比混匀，置三角烧杯中充分混匀后·于37℃土1℃恒温培养箱放置4h6h·使肌肉组织完全消化。可根据不同水产品种类以及消化时间对胃蛋白酶浓度和使用量进行调整。5.1.2.3过滤
消化后的悬液经10目网筛过滤，除去粗壳：再用40目网筛过滤·除去细壳，并用生理盐水冲洗网筛上的残留物。收集滤液置锥形量杯内·搅拌后沉淀15min。轻轻倾去上清液加人生理盐水至锥形量杯的最大刻度处，搅拌后再沉淀15min。通常需用生理盐水洗涤滤液中的沉淀3次~5次，直至上清液透明为止，沉淀备用。
5.1.2.4镜检
全部沉淀物分次转移至玻璃平Ⅲ，在体视显微镜下去除沉淀中的杂质，分离收集疑似囊蝴，用生物显微镜观察囊形态。具备5.1.1.2形态特征的囊，可判定为疑似并殖吸虫囊坳，疑似并殖吸虫囊蝴立即用于DNA提取或一20C保存备用，5.2PCR方法
5.2.1DNA提取
取符合并殖吸虫囊形态特征的单个或多个疑似囊坳用生理盐水洗净，放人1.5mL离心管中，加DNA裂解液500μL，再加人少量玻璃珠振荡5min~10min，匀浆使囊坳充分裂解。加人蛋白酶K10μL，混勺.55℃振荡消化2h。加入苯酚/三氯甲烷/异戊醇（25：24：1）240L，混勾：4℃12000r/min离心10min。吸取上清（约500μL）加人新的1.5mL离心管，加人2倍体积一20℃预冷的无水乙醇，充分混匀，4℃12000r/min离心15min。沉淀用75%乙醇700L离心洗涤1次~2次，每次4℃12000r/min离心3min。倒干乙醇，37℃千燥后加人1×TE溶液（pH8.0）100μL溶解3
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DNA.立即用于检测或一20℃保存备用。注，根据实验室实际情况，可使用经验证的商品化组织DNA提取试剂盒提取DNA5.2.2PCR反应体系
在PCR管中依次加人10×PCR缓冲液5.0L、MgC5.0L、dNTPs2.0L、正向引物和反向引物各2.0L耐热DNA聚合酶0.5LDNA模板2.5L、加灭菌去离子水至总体积50L。每次试验需设阳性对照、空白对照。阳性对照用并殖吸虫囊坳或成虫的DNA或者相应基因片段的质粒做模板、空白对照用灭菌去离子水做模板5.2.3PCR反应条件
95℃预变性1min：94℃变性50s，68℃退火1min，68℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min；4C保存。
5.2.4电泳
取PCR扩增产物10L与6×上样缓冲液2.0L混合，加样于含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶中其中的一孔加DNA分子量标准。1XTAE缓冲液，5V/cm恒压电泳30min~40min，用凝胶成像系统观察和记录结果。
5.2.5PCR结果判定
阳性对照出现预期大小的条带（520bp），空白对照无条带。待测样品扩增出现预期大小条带，可判PCR结果为阳性：无扩增条带或未扩增出预期大小的条带均判为PCR结果阴性。取PCR结果为阳性的PCR产物进行基因序列双向测序，将测序结果与并殖吸虫的参考序列（见附录B)进行同源性比对。
结果报告
6.1形态学方法检出疑似并殖吸虫囊坳、PCR结果为阳性且扩增片段基因序列与并殖吸虫参考序列同源性95%.报告检出并殖吸虫囊蜴6.2形态学方法鉴定未检出囊蝴、或PCR结果为阴性、或基因序列与并殖吸虫参考序列同源性<95%、报告未检出并殖吸虫囊蝴4
并殖吸虫囊呦的模式图见图A.1。卫氏并殖吸虫套
排滞囊
100μm
附录A
并殖吸虫囊形态
斯氏并殖吸虫要
并殖吸虫囊蝴的实物图见图A.2。肠管
—排漫素
并殖吸虫囊蝴模式图
斯氏并殖吸虫囊
卫氏并雅吸虫费约
100μmbzxz.net
三种并殖吸虫囊蝴的实物图
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三平正并殖吸虫妻够
三平正并殖吸虫囊蝎
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附录B
并殖吸虫参考序列
卫氏并殖吸虫（Paragonimuswestermani）ITS2参考序列B.1
TGGTACCGGTGGATCACTCGGCTCGTGTGTCGATGAAGAGCGCAGCCAACTGTGTGAATTAATGCGAACTGCATACTGCTTTGAACATCGACATCTTGAACGCATATTGCGGCCACGGGTTAGCCTGTGGCCACGCCTGTCCGAGGGTCGGCTTATAAACTATCGCGACGCCCAAAAAGTCGCGGCTTGGGTTTTGCCAGCTGGCGTGATCTCCCCAATCTGGTCTTGTGCCTGTGGGGTGCCAGATCTGTGGCGTTTCCCTAACATACTCGGGCGCACCCACGTTGCGGCTGAAAGCCTTGACGGGGATGTGGCAACGGAATCGTGGCTCAGTGAATGATTTATGTGCGCGTTCCGCTGTCCTGTCTTCATCTGTGGTTTATGTTGCGCGTGGTCTGCTTTCGATGCTGACCTACGTATGTGCCATGTGGTTCATTCTCCTGACCTCGGATCAGACGTGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCACTAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACCAGGATCCCA
斯氏并殖吸虫（Paragonimusskrjabini）ITS2参考序列B.2
TGGTACCGGTGGATCACTCGGCTCGTGTGTCGATGAAGAGCGCAGCCAACTGTGTGAATTAATGTGAACTGCATACTGCTTTGAACATCGACATCTTGAACGCATATTGCGGCCACGGGTTAGCCTGTGGCCACGCCTGTCCGAGGGTCGGCTTATAAACTATCGCGACGCCCAAAAAGTCGCGGCTTGGGTTTTGCCAGCTGGCGTGATTTCCCCAACCTGGCCTCGTGGCTGTGGGGTGCCAGATCTGTGGCGTTTCCCTAACATATCCGGGCGTACCCATGTTGTGGCTGAAAGCCTTGATGGGGATGTGGCAACGGAATCGTGGCTCAGTGATTGATTTGTGCGCGTTCCGCTATCCTATCATCGTCTATGGTTGATGTTGCGCGTGGTGTGTGCCTGATGCTGACCTATGTATGTGCCATGTGGCTCATTCTCCTGACCTCGGATCAGACGTGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCACTAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACCAGGATCCCA
三平正并殖吸虫（Euparagonimuscenocopiosus）ITS2参考序列TGGTACCGGTGGATCACTCGGCTCGTGTGTCGATGAAGAGCGCAGCCAACTGTGTGAATTAATGCGAACTGCATACTGCTTTGAACATCGACATCTTGAACGCATATTGCGGCCACGGGTTAGCCTGTGGCCACGCCTGTCCGAGGGTCGGCTTATAAACTATCGCGACGCCCAAAAAGTCGCGGCTTGGGTTTTGCCAGCTGGCGTGATTTCCCCAAATCTGGCCTCGTGCCTGTGGGGTGCCAGATCTATGGCGTTTCCCTAACATATCCGGGCGTACCCATGTTGTGGCTGAAAGCCTTGACGGGGATGTGGTAACGGAATCGTGGCTCAGTGAATGATTTGTGTGCGCGTTTCGTTGTCCCGTCTTCATCTATGGTTGATGTTGCACGTGGTCTGCGTCCGATGCTGACCTACGTATGTGCCGTTTGGCTCATTTTCCTGACCTCGGATCAGACGTGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCACTAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACCAGGATCCCA
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