本标准规定了动物性水产品及其制品中曼氏迭宫绦虫裂头蚴的形态学和PCR检验方法。 本标准适用于动物性水产品及其制品中曼氏迭宫绦虫裂头蚴的检验。

中华人民共和国国家标准
GB31610.6-2023
食品安全国家标准
动物性水产品及其制品中
曼氏迭宫虫裂头坳的检验
2023-09-06发布
中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局
2024-03-06实施
1范围
食品安全国家标准
动物性水产品及其制品中
曼氏选宫终虫裂头呦的检验
GB31610.6—2023
本标准规定了动物性水产品及其制品中曼氏送宫终虫（Spirometramansoni）裂头的形态学和PCR检验方法，
本标准适用于动物性水产品及其制品中曼氏选宫终虫裂头蜘的检验。2原理
动物性水产品及其制品中的曼氏送宫终虫裂头蝴主要寄生于蛙等水产品的肌肉内，解剖分离获得虫体，根据裂头螃的形态结构·初步判断裂头呦种类：通过扩增曼氏选宫缘虫裂头线粒体DNA的细胞色素氧化酶（cozI)基因片段并测序，进行曼氏送宫练虫裂头劾的鉴定仪器和设备
生物显微镜：40×~100×
体视显微镜：7.5×~150×。
PCR扩增仪。
凝胶成像系统。
电泳仪。
高速离心机：转速≥12000r/min。微量移液器：0.2μL~2.5L、1μL~10μ、10μL~100L100~1000试剂和材料
1mol/LTris-HCl溶液（pH8.0)
0.5mol/LEDTA溶液（pH8.0）
10%SDS溶液。
5mol/LNaCI溶液
20mg/mL蛋白酶K
苯酚/三氯甲烷/异戊醇（25：24：1）。三氯甲烧。
5U/L耐热DNA聚合酶。
10XPCR缓冲液。
25mmol/LMgCl.
GB31610.6—2023
dNTPs：dATP、dTTP、dCTP.dGTP每种浓度为2.5mmol/L，琼脂糖：电泳级。
50XTAE缓冲液，使用前用去离子水稀释成1XTAE缓冲液1XTE溶液（pH8.0)
10mg/mL漠化乙锭（EB）或其他核酸染料。6X上样缓冲液。
100bp~2000bpDNA分子量标准wwW.bzxz.Net
引物：浓度为10umoL/L，
正向引物SEF3：5-AATTCTTTCTGCTTGTGTGT-3反向引物SERI：5-ATCAACAAATAATCCACGCAC-3扩增曼氏选宫综虫裂头动cozI基因片段长度为475bp。4.2
试剂配制
4.2.1生理盐水：称取8.5gNaC1溶解于900mL去离子水，加去离子水至1000mL4.2.21mol/LTris-HCI溶液：称取121.1gTris（三羟甲基氨基甲烷）溶解于800mL去离子水，用盐酸调节pH至8.0，加去离子水至1000mL4.2.30.5mol/LEDTA溶液：称取186.1gNaEDTA·2HO（二水合乙二胺四乙酸二钠）溶解于800mL去离子水，搅拌溶解，用NaOH调节pH至8.0，加去离子水至1000mL。4.2.45mol/LNaCl溶液：称取292.5gNaCl溶解于900mL去离子水，加去离子水至1000mL。4.2.5裂解液：10%SDS溶液100mL、1mol/LTris-HCI溶液10mL、0.5mol/LEDTA溶液200mL、5mol/LNaCl溶液20mL，加灭菌去离子水至1000mL1.5%琼脂糖凝胶：琼脂糖1.5g，加入1×TAE缓冲液至100mL，加热至完全融化后冷却至4.2.6
60℃~70℃，加人10mg/mL溴化乙锭5L，混勺，制备凝胶。5检测方法
形态学方法
5.1.1样品制备
用手术剪对待检的蛙等动物性水产品或其制品逐只进行解剖。去皮后按照皮下、四肢、躯干、内脏、头部的顺序先肉眼观察，后置于体视显微镜下，用解韵针分离肌肉和筋膜，若发现乳白色扇平带状虫体，将其完整取出。
5.1.2镜检
用生物显微镜观察虫体形态，虫体呈白色、带状，大小（0.5cm~80cm）×（0.3cm~1cm）虫体头端膨大，圆形或圆锥形，中央有一明显凹陷体不分节，具有不规则横皱褶：后端呈钝圆形，具有很强的伸缩辅动能力，其模式图见图A.1其实物图见图A.2。具备上述特征的虫体，判断为疑似曼氏送宫虫裂头够。虫体立即用于DNA提取或一20℃保存备用。5.2PCR方法
5.2.1DNA抽提
挑取5.1.2分离的疑似虫体，放人1.5mL离心管中，加裂解液500L，匀浆。加人蛋白酶K10μL，55℃水浴至虫体被完全消化（1h～3h）：在混合液中加人苯酚/三氯甲烷异戊醇（25+241）500L，2
GB31610.6—2023
混匀，4℃12000r/min离心5min，取上层水相，加入等体积的三氯甲烷，混匀，4℃12000r/min离心5min。取上层水相加入2倍体积一20℃预冷的无水乙醇，放置1h，充分混勾，4℃12000r/min离心15min。倾去上清液，加人75%乙醇700L冲洗沉淀，4℃12000/min离心5min，弃上清液，干燥后加人50L1×TE溶液溶解DNA，立即检测或-20C保存备用。注，根据实验室实际情况，可使用经验证的商品化组织DNA提取试剂盒提取DNA。5.2.2PCR反应体系
在PCR管中依次加人10XPCR缓冲液5.0L、MgCl5.0L、dNTPs2.0L、引物SEF3和SERI各2.0L、耐热DNA聚合酶0.5L、DNA模板2.5μL，加灭菌去离子水至总体积50L，每次试验需设阳性、阴性和空白对照。阳性对照用曼氏迭宫综虫裂头鳞DNA或含有目标基因序列的质控品，阴性对照用不含虫体的动物性水产品DNA做模板，空白对照用灭菌去离子水做模板5.2.3PCR反应条件
94℃预变性5min；94℃变性30s.55℃退火30s.72℃延伸1min，扩增35个循环：72℃延伸10min，4℃保存。
5.2.4电泳
取PCR扩增产物10L与6×上样缓冲液2L混合，加样于1.5%琼脂糖凝胶中，其中一孔加人DNA分子量标准。1×TAE电泳缓冲液，5V/cm恒压电泳30min~40min，用凝胶成像系统观察和记录结果。
5.2.5PCR结果判定
阳性对照出现预期大小的条带（475bp），阴性对照和空白对照无条带，待测样品扩增出预期大小的条带，可判定PCR结果为阳性：无扩增条带或未扩增出预期大小的条带均判为PCR结果为阴性。取POR结果为阳性的PCR产物进行基因序列双向测序，将测序结果与曼氏送宫终虫裂头嗮参考序列（见附录B)进行同源性比对。6结果报告
6.1形态学方法检出疑似裂头颤、PCR结果为阳性且扩增片段基因序列与曼氏送宫虫裂头蝴参考序列同源性≥98%，报告检出曼氏送宫虫裂头。6.2形态学方法未检出裂头蝴、或PCR结果为阴性、或扩增片段基因序列与曼氏选宫絲虫裂头蜘参考序列同源性<98%.报告未检出曼氏送宫终虫裂头动3
GB31610.6—2023
附荣A
曼氏选富缘虫裂头触形态
A.1曼选宫终点裂头细模式图见图A.1。图A.1
曼氏送练虫票头物模式图（仿诸欣平等.2019）A.2曼氏送官终点製头贴实物图见图A.2图A.2
更氏选富缘虫飘头实物围
附录B
曼氏选宫终虫裂头蝴参考序列
GB31610.6—2023
AATTCTTTCTGCTTGTGTGTTGGATAAAATTTTGCATGACACGTGGTTTGTGGTGGCTCATTTTCATTATGTTATGTCTTTGGGTTCTTATATTAGGGTTATTATATTTTTTGTTTGGTGATGGCCTGTTATCACAGGGGTTAGCTTGAATAAGTATTTGTTACAGTGTCATTGTATAGTATCAAATGTGGGCTTTAATTTGTGTTTTTTTCCTATGCATTATTTTGGTATTTGTGGTTTACCTCGGCGTGTTTGTGTGTATGAGTCAGGGTACGCTTGAGTTAATATGCTTTGTTCAATAGGTTCTTTTGTTTCTGCCTTTAGTGGTTGCTTTTTTATTTTTATTTTATGGGAGTCTTTAGCTAAAAAGAATGTTGTTATAGGTTATTATGGTAGTTCTTCAACTTTGCTTAATTTGTGTTGATCGCCAGTGCCTTACCACAGTAATTTTTTTGTGCGTGGATTATTTGTTGAT
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