本标准规定了食品中唾液酸的测定方法。 本标准第一法液相色谱-紫外检测法适用于燕窝及其制品中结合态唾液酸的测定，第二法液相色谱-荧光检测法和第三法液相色谱-质谱/质谱法适用于态乳、乳粉、糕点、饮料中唾液酸的测定。
本标准代替GB/T 30636-2014《燕窝及其制品中唾液酸的测定 液相色谱法》。
本标准与GB/T 30636-2014相比，主要变化如下：
——修改了标准名称；
——修改方法的适用范围，增加了液态乳、乳粉、糕点、饮料；
——明确了燕窝及其制品中测定的目标物质为结合态唾液酸；
——增加了液相色谱-荧光检测法和液相色谱-质谱/质谱法。

中华人民共和国国家标准
GB31614.1——2023
食品安全国家标准
食品中睡液酸的测定
2023-09-06发布
2024-03-06实施
中华人民共和国国家卫生健康委员会发布
国家市场监督管理总局
本标准代替GB/T306362014《燕窝及其制品中睡液酸的测定液相色谱法》本标准与GB/T
30636—2014相比，主要变化如下：一一修改了标准名称；
修改了方法的适用范围，增加了液态乳、乳粉、糕点、饮料：明确了燕窝及其制品中测定的目标物质为结合态睡液酸：一增加了液相色谱-荧光检测法和液相色谱-质谱/质谱法。GB
31614.12023
1范围
食品安全国家标准
食品中睡液酸的测定
本标准规定了食品中睡液酸的测定方法。GB31614.1—2023
本标准第一法液相色谱一紫外检测法适用于燕窝及其制品中结合态睡液酸的测定，第二法液相色谱-荧光检测法和第三法液相色谱一质谱/质谱法适用于液态乳、乳粉、糕点、饮料中睡液酸的测定第一法液相色谱-紫外检测法
2原理
样品在盐酸溶液中加热水解，释放出结合态睡液酸，样品试液用强阴离子交换色谱柱分离，紫外检测器或二极管阵列检测器检测，外标法定量。3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水
3.1试剂及材料
3.1.1乙腈(CHsCN)：色谱纯。
3.1.2磷酸(H3PO4)：色谱纯。
3.1.3浓盐酸(HCI):12
mol/L。
3.1.4透析袋：可透过相对分子质量7000以下的化合物，临用前用水浸泡1h。3.1.5微孔滤膜：0.45μm，有机相型。3.2试剂配制
3.2.1盐酸溶液（0.05mol/L)：吸取4.17mL浓盐酸，溶于水并稀释至1000mL。3.2.20.1%磷酸溶液：吸取1mL磷酸，溶于水并稀释至1000mL。3.2.30.1%磷酸溶液-乙睛（4+6）：将0.1%磷酸溶液和乙睛按4：6的体积比混合均匀。3.3标准品
睡液酸（N-乙酰神经氨酸，CHigNOg,CAS质证书的标准品。
3.4标准溶液配制
号131-48-6：纯度≥96%，或经国家认证授予标准物3.4.1睡液酸标准储备液（1000mg/L)：准确称取适量唾液酸标准品（按纯度进行折算），用水溶解并GB31614.1—2023
配制成质量浓度为1000mg/L的标准储备溶液，于4℃下避光保存，保存期6个月。3.4.2睡液酸标准系列工作液：分别吸取睡液酸标准储备液（1000mg/L)0.1mL、0.5mL、1.0mL、5.0mL、10.0mL和20.0mL于100mL容量瓶中，加入0.1%磷酸溶液-乙睛（4+6）定容至刻度，混匀。睡液酸标准系列工作液的质量浓度分别为1.0mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L50.0mg/L、100.0mg/L和200.0mg/L,临用现配。
仪器和设备
4.1液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。4.2
恒温水浴锅。
涡旋混合器。
4.4分析天平：感量为0.1mg和0.01g。4.5匀浆机：转速不低于10000r/min。4.6烘箱。
高速离心机
筛网：筛网孔径0.150mm。
4.9研钵。
5分析步骤
5.1样品前处理
5.1.1试样制备
5.1.1.1：燕窝（盏、条、碎等）和固态燕窝制品称取10g燕窝、固态燕窝制品在101℃105℃烘箱中烘干至恒重（两次质量差不超过2mg），在干燥器中冷却后研磨，全部过100目筛（筛网孔径0.150mm）后装入洁净容器，放于干燥器内，密闭备用。
5.1.1.2液态燕窝制品
液态燕窝制品混匀后取200g，先低速匀浆，再缓慢升至转速10000r/min，匀浆3min，静置至泡沫消除，装入洁净容器，密闭避光，冷藏保存5.1.2试样提取
5.1.2.1燕窝(盏、条、碎等)和固态燕窝制品睡液酸总量的测定：称取0.1g（精确至0.0001g）样品于25mL具塞比色管中，加入10mL盐酸溶液，盖上玻璃塞，涡旋混匀，置于80℃水浴中水解40min，在水浴过程中每5min振荡一次，取出离心管，冷却至室温。将水解液转移至100mL容量瓶，用适量水洗涤离心管两次并转移至容量瓶中，用0.1%磷酸溶液-乙睛（4+6）定容至刻度，混匀。移取2mL于离心管中，15000r/min离心3min，取上清液过0.45μm微孔滤膜后，待测。游离态唾液酸含量的测定：称取0.1g（精确至0.0001g）样品于25mL具塞比色管中，加入10mL水，涡旋振荡3min，将试样溶液转移至100mL容量瓶中，用适量水洗涤离心管两次并转移至容量瓶中，用0.1%磷酸溶液-乙睛（4+6）定容至刻度，混匀。移取2mL于离心管中，15000r/min离心3min,取上清液过0.45μm微孔滤膜后，待测。5.1.2.2液态燕窝制品
31614.1-2023
结合态睡液酸含量的测定：称取10g（精确至0.01g）样品置于透析袋中（试样体积不超过透析袋容积的20%），扎紧透析袋两端，置于1000mL烧杯中在流动的自来水下透析24h。透析后，将此透析袋中的试液转移至25mL具塞比色管中，加少量水冲洗透析袋，合并至比色管中，加入104！L浓盐酸，加水定容至25mL，混匀，使水解液中盐酸的质量浓度为0.05mol/L。盖上玻璃塞，置于80℃水浴中水解40min,取出比色管，冷却至室温。将水解液转移至100mL容量瓶中，用适量水洗涤比色管两次并转移至容量瓶中，用0.1%磷酸溶液-乙腈（4+6）定容至刻度，混匀。移取2mL于离心管中，15000r/min离心3min，取上清液过0.45um微孔滤膜后，待测。5.2液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
色谱柱：SAx强阴离子交换柱，250mm×4.6mm（内径），5um，或相当者。柱温：30℃。
检测波长：205nm。
流动相：0.1%磷酸溶液-乙腈（40+60，体积比）。流速：1.0mL/min。
f)进样量：10μL。
5.3标准曲线的制作
将标准系列工作液分别注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以标准系列工作液中睡液酸的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。睡液酸标准溶液的色谱图参见附录A中图A.1。5.4试样溶液的测定
将试样溶液注入液相色谱仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到待测液中睡液酸的质量浓度。标准工作液和待测样液中睡液酸的响应值均应在仪器线性响应范围内。如果含量超过标准曲线线性范围：需调整称样量或定容体积重新检测。6分析结果的表述
试样中结合态睡液酸的含量按式（1）计算。X--PxV
mX1000
式中：
一一试样中睡液酸的含量，单位为克每千克(g/kg);由标准曲线得到的试样溶液中唾液酸的质量浓度，单位为毫克每升(mg/L)：一试样的定容体积，单位为毫升(mL);试样的取样量，单位为克(g);
1000一一换算系数。
计算结果需扣除空白值，保留3位有效数字。.. ()
对于燕窝和固态燕窝制品，分别测定睡液酸总量和游离态睡液酸含量，结合态睡液酸含量由睡液酸3
GB31614.1—2023
总量减去游离态睡液酸含量计算得到。7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。8其他
燕窝和固态燕窝制品，当称样量为0.1g时，检出限为0.3g/kg，定量限为1.0g/kg；液态燕窝制品，当称样量为10g时，检出限为0.003g/kg，定量限为0.01g/kg。液相色谱-荧光检测法
第三法
9原理
样品在盐酸溶液中加热水解，释放出睡液酸，提取液经固相萃取柱净化后，与邻苯二胺反应生成荧光衍生物，样品试液用反相色谱柱分离，荧光检测器检测，外标法定量试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水，10.1试剂及材料
乙(CH3CN)：色谱纯。
甲醇(CHOH)：色谱纯。
磷酸(HPO)：色谱纯。
四氢呋喃(C。HaO)：
色谱纯。
浓盐酸(HCI):12
mol/L。
邻苯二胺盐酸盐(C。HsN2-2HC1)。三氯甲烷(CHCl3)。
含极性基团的反相聚合物固相萃取柱：60mg,3mL，或相当者。含极性基团的反相聚合物固相萃取柱吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按照一定比例聚合成的大孔聚合物。
10.1.9微孔滤膜：0.45um，有机相型。10.2试剂配制
10.2.1盐酸溶液（0.05mol/L）：吸取4.17mL浓盐酸，溶于水并稀释至1000mL。10.2.2乙睛-水溶液（1+9）：将乙睛和水按1：9的体积比混合均匀。10.2.3邻苯二胺盐酸盐溶液（50mg/mL)：称取2.5g邻苯二胺盐酸盐，加入50mL0.05mol/L盐酸溶液溶解，混匀，现用现配。
10.2.40.2%磷酸溶液：吸取2mL磷酸，溶于水并稀释至1000mL。4
10.3标准品
睡液酸(N-乙酰神经氨酸，CH，。NOg,CAS物
质证书的标准品。
10.4标准溶液配制
GB31614.1—2023
号131-48-6)：纯度≥96%，或经国家认证授予标准10.4.1睡液酸标准储备液（1000mg/L)：准确称取适量睡液酸标准品（按纯度进行折算），用水溶解并配制成质量浓度为1000mg/L的标准储备溶液，于4℃下避光保存，保存期6个月。10.4.2睡液酸标准系列工作液：分别吸取睡液酸标准储备液（1000mg/L)0.2mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL10.0mL和20.0mL手100mL容量瓶中，用乙-水溶液（1+9）定容至刻度，混匀。睡液酸标准系列工作液的质量浓度分别为2.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、40.0mg/L、100.0mg/L和200.0mg/L，临用现配。
仪器和设备
液相色谱仪：配有荧光检测器。11.1
11.2恒温水浴锅。
11.3涡旋混合器。
11.4分析天平：感量为0.1mg和0.01g。匀浆机：转速不低于10000r/min。11.5
11.6高速离心机。
分析步骤
12.1样品前处理
12.1.1试样制备
液态试样摇匀：基质均匀的半固态试样和粉状试样直接用于下一步试样提取；其他试样需匀浆或粉碎均匀。
12.1.2试样提取
称取1g（精确至0.01g）样品于25mL具塞比色管中（固体样品先加入3mL水，涡旋振荡30s）沿管壁缓慢加入10mL盐酸溶液，一边加一边振荡，盖上玻璃塞，涡旋混匀，置于80℃水浴中水解40min，在水浴过程中每5min振荡一次。取出比色管，冷却至室温，用乙-水溶液（1+9）定容至25mL，混匀，静置5min。取10mL上层溶液放入离心管中，加入5mL三氯甲烷，涡旋混匀后，9000r/min离心5min，取上清液待净化。12.1.3试样净化
固相萃取柱依次用3mL甲醇和3mL水活化，负压抽干，样液以小于1mL/min的流速通过固相萃取柱，收集流出液，过0.45um微孔滤膜后，待衍生化。12.1.4衍生化
准确吸取1.0mL样液于10mL具塞比色管中，准确加入1.0mL邻苯二胺盐酸盐溶液，盖上玻璃GB31614.1—2023
塞，混匀，置于80℃水浴中反应35min，取出比色管，冷却至室温，过0.45μm微孔滤膜后，待测。同时做睡液酸标准系列工作溶液的衍生化，衍生后标准系列工作溶液的质量浓度分别为1.0mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、50.0mg/L和100.0mg/L。12.2液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
色谱柱：C，8柱，250mmx4.6mm（内径），5μm，或相当者。a)
柱温：30℃。
荧光检测器激发波长：235nm，发射波长：414nm。c)
流速：1.0mL/min。
进样量：10μL。
流动相：A相：950mL0.2%磷酸溶液+50mL四氢呋喃：B相：甲醇。梯度洗脱，见表1。表1流动相梯度洗脱程序
时间/min
12.3标准曲线的制作
将衍生后的标准系列工作液分别注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积，以标准系列工作液中睡液酸的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。睡液酸标准溶液的色谱图参见附录B中图B.1。12.4试样溶液的测定
将衍生后的试样溶液注入液相色谱仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到待测液中睡液酸的质量浓度。标准工作液和待测样液中睡液酸的响应值均应在仪器线性响应范围内。如果含量超过标准曲线线性范围，需调整称样量或定容体积重新检测。13分析结果的表述
试样中睡液酸的含量按式（2)计算式中：此内容来自标准下载网
x=exvxf
m×1000
试样中睡液酸的含量，单位为克每千克（g/kg)：由标准曲线得到的试样溶液中睡液酸的质量浓度，单位为毫克每升(mg/L);试样的定容体积，单位为毫升(mL);稀释倍数：
——试样的取样量，单位为克(g);m
1000——换算系数。
计算结果需扣除空白值，保留3位有效数字。14精密度
GB31614.1—2023
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%15其他
称样量为1g时，睡液酸的检出限为0.02g/kg，定量限为0.05g/kg去液相色谱-质谱/质谱法
第三法
16原理
样品在盐酸溶液中加热水解，释放出唾液酸，提取液经固相萃取柱净化后，样品试液用反相色谱柱分离，液相色谱一质谱/质谱测定，外标法定量。17试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。17.1试剂及材料
乙腊(CH3CN)：色谱纯。
色谱纯。
甲醇(CH3OH)：
甲酸(HCOOH)：
色谱纯。
4浓盐酸(HCI):12
mol/L。
三氯甲烷（CHC13）。
17.1.6含极性基团的反相聚合物固相萃取柱：60mg.3mL，或相当者。含极性基团的反相聚合物固相萃取柱吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡略烷酮两种单体按照一定比例聚合成的大孔聚合物。
17.1.7微孔滤膜：0.22um，有机相型。2试剂配制
17.2.1盐酸溶液（0.05mol/L)：吸取4.17mL浓盐酸，溶于水并稀释至1000mL。17.2.2乙-水溶液（1+9）：将乙睛和水按1：9的体积比混合均匀。17.2.30.1%甲酸溶液：吸取1mL甲酸，溶于水并稀释至1000mL。17.3标准品
睡液酸(N-乙酰神经氨酸，C,H,NOg,CAS号131-48-6）：纯度≥96%，或经国家认证授予标准物
质证书的标准品。
GB31614.1-—2023
17.4标准溶液配制
17.4.1睡液酸标准储备液（1000mg/L）：准确称取适量唾液酸标准品（按纯度进行折算），用水溶解并配制成质量浓度为1000mg/L的标准储备溶液，于4℃下避光保存，保存期6个月。17.4.2睡液酸标准中间液（100mg/L）：吸取标准储备液（1000mg/L)10mL于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，于4℃下避光保存，保存期1个月。17.4.3睡液酸标准系列工作液：分别吸取睡液酸标准中间液（100mg/L)0.1mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL和2.0mL于100mL容量瓶中，用乙晴-水溶液（1+9）定容至刻度，混匀。睡液酸标准系列工作液的质量浓度分别为0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L和2.0mg/L，临用现配。18仪器和设备
18.1液相色谱串联质谱仪：配电喷雾离子源。18.2恒温水浴锅。
18.3涡旋混合器。
18.4分析天平：感量为0.1mg和0.01g。18.5匀浆机：转速不低于10000r/min。18.6高速离心机。
分析步骤
19.1样品前处理
19.1.1试样制备
液态试样摇匀，基质均匀的半固态试样和粉状试样直接用于下一步试样提取，其他试样需匀浆或粉碎均匀。
19.1.2试样提取
称取1g（精确至0.01g）样品于25mL具塞比色管中（固体样品先加入3mL水，涡旋振荡30s），沿管壁缓慢加入10mL盐酸溶液，一边加一边振荡，盖上玻璃塞，涡旋混匀，置于80℃水浴中水解40min.在水浴过程中每5min振荡一次。取出比色管，冷却至室温，用乙睛-水溶液（1+9）定容至25mL.混匀，静置5min。取10mL上层溶液放入离心管中，加入5mL三氯甲烷，涡旋混匀后9000r/min离心5min，取上清液待净化。19.1.3试样净化
固相萃取柱依次用3mL甲醇和3mL水活化，负压抽干，样液以小于1mL/min的流速通过固相萃取柱，收集流出液。准确吸取50μL样液，加入950μL乙睛-水溶液（1+9)，混匀，过0.22μm微孔滤膜后，待测。
19.2液相色谱-质谱/质谱参考条件19.2.1液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
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