本文件规定了牛冷冻精液的技术要求、取样、检验规则、标志和随行文件、包装、贮存和运输，描述了牛冷冻精液质量检验的试验方法。 本文件适用于牛冷冻精液。 　　

ICS65.020.30
CCSB43
中华人民共和国国家标准
GB4143—2022
代替GB4143—2008
牛冷冻精液
Frozen bovine semen
2022-12-29发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2024-01-01实施
2规范性引用文件
术语和定义
技术要求
5取样
基本要求
取样量
取样方法
5.4样品贮存
6试验方法
6.1剂量
精子活力
前向运动精子数
6.4精子畸形率
菌落总数
7检验规则
7.1组批
检验类型
判定规则
8标志和随行文件
8.2随行文件
9包装、贮存和运输
内包装
外包装
存和运输
附录A（规范性）
精子活力
牛冷冻精液质量检验方法
前向运动精子数
精子畸形率
GB4143—2022
GB4143—2022
菌落总数
附录B（资料性）
编制原则·
牛品种代码编制
编制方法
136个牛品种代码
参考文献
......
GB4143—2022
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件代替GB4143—2008《牛冷冻精液》，与GB4143—2008相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下：
更改了“菌落总数”的定义（见3.3,2008年版的3.4)；删除了“种公牛”和“新鲜精液”的要求（见2008年版的4.1、4.2)；-将“冻精外观”的技术要求调整为“包装”要求（见9.1，2008年版的4.3）；更改了“剂量”“精子活力”“前向运动精子数”“精子畸形率”和“菌落总数”的技术要求（见第4章，2008年版的4.4、4.5.1、4.5.2、4.5.3、4.5.4)；删除了“抽样”（见2008年版的第5章、附录A和B.1)，增加了“取样”内容（见第5章）；更改了“检验类型”“判定规则”（见7.2、7.3，2008年版的6.4、第7章）；增加了“型式检验”情况的描述（见7.2.2）；-增加了“随行文件”（见8.2)；增加了“贮存”“运输”（见9.3）。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出并归口。本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：-1984年首次发布为GB4143—1984，2008年第—次修订；一本次为第二次修订。
1范围
牛冷冻精液
GB4143—2022
本文件规定了牛冷冻精液的技术要求、取样、检验规则、标志和随行文件、包装、贮存和运输，描述了牛冷冻精液质量检验的试验方法。本文件适用于牛冷冻精液。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅注日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB4789.22016食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定GB/T5458液氮生物容器
GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定GB/T14174大口径液氮容器
GB/T30396—2013牛冷冻精液包装、标签、存和运输3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
精子活力
spermmotility
在37℃环境下前向运动精子数占精子总数的百分率。［来源：GB20557-—2006，3.2]3.2
精子畸形率abnormal spermpercentage畸形精子数占精子总数的百分率。［来源：GB20557—2006，3.3]
菌落总数
aerobicplatecount
每剂量精液在一定条件下培养后观察到的微生物菌落总数。3.4
冷冻精液frozen semen
经特殊方法处理的精液超低温冷冻后在液氮中（一196℃)长期保存。［来源：GB20557—2006，3.5]］3.5
前向运动精子数
numberof progressivelymotile sperm每剂量精液中呈前向运动精子的总数。1
GB4143-—2022
【来源：GB23238—2021,3.5]］技术要求
牛冷冻精液应符合表1中的规定。项目
精子活力
前向运动精子数
精子畸形率
菌落总数
104个/剂
CFU/剂
表1技术指标
微型≥0.19
中型≥0.42
普通牛、瘤牛≥40
水牛、耗牛及大额牛≥35
普通牛、瘤牛≥600
耗牛≥800
水牛及大额牛≥1000
普通牛、瘤牛≤20
水牛、耗牛及大额牛<22
≤500
注：普通牛涵盖各品种奶牛、肉牛、兼用牛和黄牛。5取样
警示：取样人员应意识到取样过程可能涉及液氮（一196℃）冻伤的危害和危险，应采取适当的安全和防护措施。
5.1基本要求
5.1.1取样应由受过培训的人员执行。取样原则应遵循随机性原则。每头公牛及每批次的牛冷冻精液被取样的机会均等。5.1.2
取样和样品保存使用的液氮生物容器应符合GB/T5458、GB/T14174的规定。5.2取样量
交收检验
每批次抽取不少于4支（含复检备样）。型式检验
每批次抽取不少于15支（含复检备样）。5.3取样方法
5.3.1每头公牛的冷冻精液样品应是同一个批次的产品。5.3.2
随机从液氮生物容器中抽取样品，样品离开液氮不应超过5s。GB4143—2022
5.3.3取样完成后应立即填写样品登记单（包括取样日期、取样地点、公牛品种、公牛号、样品生产日期或批号及取样人签字等信息）并与样品随行。5.4样品购存
样品的购存应符合GB/T30396—2013的规定。6试验方法
6.1剂量
按照附录A中A.2给出的方法检测。精子活力
按照A.3给出的方法检测。
6.3前向运动精子数
按照A.4给出的方法检测。
6.4精子畸形率
按照A.5给出的方法检测。
6.5菌落总数
按照A.6给出的方法检测。
7检验规则
7.1组批
同一头公牛、相同生产工艺、同一天采精生产的冷冻精液为一个批次。检验类型
交收检验
交收检验项目为精子活力。
7.2.2型式检验
型式检验项目为第4章的全部要求。冷冻精液生产正常时，每2个月至少进行一次型式检验。有下列情况之一时，应进行型式检验：a)
生产工艺及设备有变更时；
所用生产原料有变化时；
种公牛发生疾病康复后或注射疫苗后；停产3个月以上恢复生产时；
交收检验结果与型式检验结果有较大差异时；监督管理部门提出要求时。
GB4143—2022
判定规则
7.3.1交收检验时，样品精子活力合格，则判定该批次冷冻精液为合格；型式检验时，样品所检项目全部合格，则判定该批次冷冻精液为合格。7.3.2样品中任何一项目检验不符合规定的，应用备样进行复检，备样复检后仍不符合规定的，判定该批次冷冻精液为不合格
7.3.3各项目检测结果的极限数值判定按GB/T8170中修约值比较法执行。8标志和随行文件
1标志
应在牛冷冻精液细管管壁上及包装袋上清晰印制以下标志内容：生产者；
公牛品种代码：代码编制见附录B；公牛号；
生产日期。
随行文件
随行文件应包括冷冻精液来源公牛的系谱及种用性能资料。包装、贮存和运输
内包装
细管封口严密、标志清晰。
2外包装
产品外包装应符合GB/T30396—2013中第4章要求。3贮存和运输
贮存和运输应符合GB/T30396—2013中第7章、第8章要求。A.1通则
附录A
(规范性）
牛冷冻精液质量检验方法
GB4143—2022
试验中除非另有规定，仅使用分析纯试剂。试验用水为新制备的去离子水或蒸馏水。试验所用的测量仪器应经过计量检定机构检定合格，并在有效期内。A.2剂量
A.2.1器材
分度吸量管：精度0.01mL。
细管专用剪刀。
细管专用推针。
试管：5.0mL。
试样制备
取3剂细管冷冻精液于室温自然解冻后，剪去封口端，用细管推针将全部样品推至同一个试管内。A.2.3
试验步骤
用分度吸量管吸取全部试样，并读取试样总量。A.2.4试验数据处理
按式（A.1)计算剂量值，结果保留2位小数：V
式中：
V—剂量值，单位为毫升(mL）；V-—3支试样总量，单位为毫升（mL）。A.3精子活力
仪器和器材
显微镜：配有相差物镜，20X、40X100X。A.3.1.2
显微摄像系统：显微镜、摄像头、电脑及显示屏。显微镜恒温载物台：37℃士1℃。恒温水浴箱：37℃士1℃。
试管：5.0mL。
移液器：量程20μL。
载玻片。
盖玻片。
...(A.1)
GB4143—2022
A.3.2试样制备
取2剂细管冷冻精液，置于37℃水浴解冻，解冻时间微型不少于10s、中型不少于15s。将解冻后样品剪去封口端，用细管推针全部推至同一个试管内，混匀后置于37℃水浴中恒温待用。A.3.3试验步骤
吸取10μL试样置于载玻片上，加盖玻片，立即在38℃恒温载物台上，用200倍～400倍显微镜观察活力，也可通过显示屏观察。分别观察2个样片，每个样片至少观察3个以上视野，并应观察不同液层内的精子运动状态，给出综合评定值。A.3.4试验数据处理
精子活力按式(A.2)计算，结果取整数：式中：
M——精子活力，%；
n1—第1个样片精子活力，%；
n2———第2个样片精子活力，%。M=ni+nz
2个样片的精子活力在重复性条件下，测定结果的相对偏差不得超过5%，否则应重检。A.4前向运动精子数
A.4.1试剂
3.0%氯化钠溶液：称取氯化钠3.0g，加蒸馏水溶解并定容至100mL。A.4.2
2设备和器材
显微镜：配有相差物镜，20X、40X、100X。A.4.2.1
A.4.2.2显微摄像系统：显微镜、摄像头、电脑及显示屏。A.4.2.3血球计数板：25X16型（汤麦式），盖玻片。A.4.2.4计数器。
A.4.2.5移液器：量程10μL、20μL、1000μL。试管：5.0mL。
A.4.3试样制备
解冻方法按A,2.2的规定。
..（A.2)
量取20μL样品注入盛有0.98mL的3.0%氯化钠溶液的试管内，混匀，使之成为50倍稀释试样。A.4.4试验步骤
应按如下步骤进行操作。
a）用盖玻片将血球计数板的计数室盖好，分别吸取1滴试样置于2个计数室边缘，使试样自行流人计数室，均充满，然后在400倍显微镜下观察计数，每试样观察2个计数室。b）每个计数室按对角线方位，选择左上、左下、右上、右下4个及中央1个共5个中方格进行分别计数，对于方格压线精子（以头部为准）采取数上不数下、数左不数右的原则。记录计数室中5个中方格精子数，2个计数室中5个中方格总精子数求算术平均数（st)。6
A.4.5试验数据处理
每剂量中前向运动精子数按式（A.3)计算，结果取整数：P=s.×5×10×1000×50×V×M
式中：
每剂量中前向运动精子数，单位为个；-2个计数室中5个中方格总精子数的平均值，单位为个；5个中方格精子数推及25个中方格的精子数；推及1mm3中精子数；bZxz.net
推及1mL中精子数；
试样稀释倍数；
样品剂量值，单位为毫升（mL）；精子活力，%。
GB4143—2022
·（A.3）
2个计数室中5个中方格的精子数，在重复性条件下，2次独立测定结果的相对偏差不得超过5%，否则应重检。
A.5精子畸形率
A.5.1试剂
姬姆萨染料。
磷酸二氢钠（NaH,PO·2H2O)。
磷酸氢二钠(NazHPO4·12H,O)。甲醇(CHOH)。
甲醛（HCHO)。
A.5.1.6甘油[C.H，（OH)]。
磷酸盐缓冲液：称取磷酸二氢钠0.55g、磷酸氢二钠2.25g，加水溶解并稀释至100mL。A.5.1.8中性福尔马林固定液：称取磷酸二氢钠0.55g、磷酸氢二钠2.25g，用0.9%氯化钠约50.0mL溶解后，加人8.0mL40%甲醛（使用前经碳酸镁中和过滤），再加0.9%氯化钠溶液稀释至100mL。A.5.1.9姬姆萨原液：称取姬姆萨染料1.0g，量取甘油66.0mL、甲醇66.0mL。姬姆萨染料放人研钵中加少量甘油充分研磨至无颗粒为止，然后将甘油全部倒人研钵并放人恒温箱中保温继续溶解4h，再加甲醇充分溶解混匀，过滤后贮于棕色瓶中待用，贮存时间越久，染色效果越好。A,5.1.10姬姆萨染液：量取姬姆萨原液2.0mL，加磷酸盐缓冲液3.0mL、蒸馏水5.0mL，现配现用。商品化的试剂按说明书配制使用。设备和器材
显微镜：配有相差物镜，20X、40X、100X。显微摄像系统：显微镜、摄像头、电脑及显示屏。A.5.2.3
电子天平：精度0.001g。
血球分类计数器。
A.5.2.5载玻片。
移液器：量程20μL。
试样制备
解冻方法按A,3.2的规定。
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