本标准规定了食品中维生素B12的测定方法。 第一法液相色谱法适用于婴幼儿食品和乳品、肉与肉制品中维生素B12的测定。 第二法液相色谱-质谱法适用于婴幼儿食品和乳品、肉与肉制品、即食谷物、烘焙食品、果冻、饮料中维生素B12的测定。 　　 　　第三法微生物法适用于婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定。 　　
本标准代替GB 5413.14-2010《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定》。
本标准与GB 5413.14-2010相比，主要变化如下：
——增加了第一法液相色谱法；
——增加了第二法液相色谱-质谱法；
——删除了规范性引用文件；
——修改了原微生物法为第三法。

中华人民共和国国家标准
GB 5009.285—2022
食品安全国家标准
食品中维生素B12的测定
2022-06-30发布
中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局　
2022-12-30实施
GB5009.285—2022
本标准代替GB5413.14—2010《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定》。本标准与GB5413.14一2010相比，主要变化如下：增加了第一法液相色谱法；
增加了第二法液相色谱-质谱法；删除了规范性引用文件；
修改了原微生物法为第三法
1范围
食品安全国家标准
食品中维生素B12的测定
本标准规定了食品中维生素B?的测定方法GB5009.285—2022
第一法液相色谱法适用于婴幼儿食品、乳及乳制品、肉及肉制品中维生素B12的测定。第二法液相色谱-质谱法适用于婴幼儿食品、乳及乳制品、肉及肉制品、即食谷物、烘焙食品、果冻、饮料中维生素B12的测定。
第三法微生物法适用于要幼儿食品、乳及乳制品中维生素B12的测定。液相色谱法
第一法
2原理
试样经酶解后，用氰化钾（或氰化钠)溶液将钴胺素异构体（羟钴胺素、甲钻钴胺素和5-脱氧腺苷钻钴胺素等)转化为氰钴胺素。样液通过免疫亲和柱净化、浓缩后，反相液相色谱柱分离，紫外检测器检测，外标法定量。
试剂和材料
除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水3.1试剂
3.1.1无水乙酸钠(CH;COONa）。3.1.2
乙酸（CHCOOH)。
甲醇（CH:OH)：色谱级。
乙睛（CH:CN）：色谱级，
三氟乙酸（CF;COOH）：色谱级。氰化钾或氰化钠（KCN/NaCN）。胃蛋白酶（CAS号：9001-75-6，活力≥400U/mg）。淀粉酶（活力≥50U/mg）。
乙醇(C2HO)。
试剂配制
乙醇溶液（25%）：量取250mL乙醇，加水稀释至1000mL，混匀。乙酸钠缓冲液（0.25mol/L）：称取20.5g无水乙酸钠，用950mL水溶解并用乙酸调pH至4.03.2.2
士0.1，用水稀释至1000mL。
GB 5009.285—2022
3.2.3鼠化钾（或氰化钠）溶液（10mg/mL）：称取1.0g氰化钾（或氰化钠）固体，加适量水溶解，并用水稀释至100mL。
注：氰化钾（或氰化钠）为剧毒化学品；操作者须带防护用具，在通风橱内进行氰化钾（或氰化钠）溶液的配制或使用。
3.2.4三氟乙酸溶液（0.04%，体积比）：量取500mL水，加入200μL三氟乙酸，混匀。3.3标准品
维生素B12（氰钻胺素）标准品（Cs3H：CoN14O1P，CAS号：68-19-9）：纯度99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。
3.4标准溶液配制
3.4.1维生素B12标准储备液（1mg/mL）：称取10mg（精确至0.01mg）维生素Bi2标准品于50mL烧杯中，用乙醇溶液溶解后，转移至10mL容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度，摇匀，转移至棕色试剂瓶，于一20℃下避光保存，有效期6个月。3.4.2维生素B12标准工作液（10μg/mL）：吸取1.00mL维生素B12标准储备液，置于100mL容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度。转移至棕色试剂瓶中，于4℃下避光保存，有效期1个月。3.4.3维生素B12标准系列工作溶液：准确吸取标准工作液30μL、60μL、90μL、150uL和200μL，分别置于10mL容量瓶中，用水定容至刻度。其浓度分别为：30ng/mL、60ng/mL、90ng/mL、150ng/mL和200ng/mL。临用现配。3.5材料
3.5.1维生素B12免疫亲和柱，柱容量≥800ng，柱回收率≥85%（验证方法参见附录A）。3.5.2玻璃纤维滤纸。
3.5.3微孔滤膜：水相，0.22um。4仪器和设备
液相色谱仪：带紫外检测器。
4.2天平：感量为0.01g、0.001g和0.00001g。3pH计：精度0.01。
水浴恒温振荡器：温度范围25℃～100℃。4.5
超声波清洗器。
离心机：转速≥10000r/min
5分析步骤
注：操作过程应避免紫外光照，并尽可能避光操作。5.1样品前处理
5.1.1试样制备
固体样品粉碎、研磨，或用绞肉机制成食糜，均质混匀。液体样品试验前振摇混匀。2
5.1.2样品提取
GB 5009.285—2022
称取5g～10g试样（精确至0.01g）于150mL具塞锥形瓶中，依次加入30mL乙酸钠缓冲液、0.2g胃蛋白酶、0.05g淀粉酶和2mL氰化钾（或氰化钠)溶液，充分混合。将样品溶液放人水浴恒温振荡器，在37℃，酶解30min（肉类样品酶解10h～16h），酶解后转人100℃水浴中，保持30min，取出冷却至室温。将样品溶液转移至100mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。移取上述溶液40mL至50mL离心管中，在10000r/min下离心10min，取上清液用玻璃纤维滤纸过滤后备用注：对于以氰钴铵素为营养强化剂，且本底中不含有其他形式钴胺素的样品，在样品提取时可不使用氰化钾（或氰化钠）。
5.1.3净化
将免疫亲和柱连接至固相萃取装置上，弃去免疫亲和柱内的缓冲液后，移取适量上述滤液（其中含维生素B12为10ng～500ng）过柱，调节过柱速度为2mL/min～3mL/min。待样液完全过柱后，用10mL水以稳定流速淋洗免疫亲和柱，抽干。在免疫亲和柱下放置10mL玻璃试管，用3mL甲醇分3次洗脱，收集全部洗脱液，在60℃以下用氮气流缓缓吹至近干，用0.04%三氟乙酸溶液定容至1.0mL，涡旋30s溶解残留物，0.22μm滤膜过滤，待测注：氰化钾（或氰化钠)废液严禁与酸混合，可加入氢氧化钠调节pH>10，再加入高锰酸钾粉末（按废液质量的3%加人），使氰化物分解，放置24h后排放。5.2液相色谱参考条件
色谱柱：Cis柱（柱长150mm，柱内径4.6mm，填料粒径2.5μm），或相当者。5.2.1食
5.2.2流动相：A相，0.04%三氟乙酸溶液；B相，乙睛。5.2.3
梯度洗脱:0min~6.0min,90%A;6.0min~8.5min,90%~0%A;8.5min~14.0min，90%A。
5.2.4流速：0.8mL/min。
5.2.5柱温：40℃。
5.2.6进样体积：100μL。
5.2.7检测波长：361nm。
5.3标准曲线的制作
将标准系列溶液由低浓度到高浓度依次注入液相色谱仪中，测定相应的色谱峰面积，以维生素B12的峰面积为纵坐标，以维生素B12的浓度为横坐标绘制标准曲线。液相色谱图见附录B中图B.1。5.4样品测定
将待测样液注人液相色谱仪中，得到待测溶液中维生素B12的峰面积，根据标准曲线得到测定液中维生素B12的浓度。待测样液中维生素B12的响应值应在标准曲线的线性范围内，超过线性范围则应稀释上机溶液，或调整取样量重新按样品分析步骤处理后再进样分析。5.5空白试验
不称取试样，按样品分析步骤操作，应不含有干扰待测组分的物质6分析结果的表述
试样中维生素B12（以氰钴胺素计)的含量按式（1)计算：3
式中：
X=p×Vi×Vs ×100
m ×V2×1 000
试样中维生素B2的含量，单位为微克每百克（μg/100g）；GB5009.285—2022
由标准曲线得到的试样溶液中维生素B12的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；样品提取液的定容体积，单位为毫升（mL）；试样过柱洗脱液的最终定容体积，单位为毫升（mL）；换算系数；
试样的取样量，单位为克（g）；上柱溶液的体积，单位为毫升（mL）；换算系数。
计算结果保留两位有效数字。
精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。8其他
当取样量为5.00g时，婴幼儿食品和乳品、肉与肉制品的检出限为0.2μg/100g，定量限为0.5μg/100g。
第二法
液相色谱-质谱法
9原理
试样经酶解后，用氰化钾（或氰化钠)溶液将钴胺素异构体（羟钴胺素、甲钴胺素和5-脱氧腺苷钴胺素等)转化为氰钴胺素。样液通过免疫亲和柱净化、浓缩后，反相液相色谱柱分离，串联质谱检测，同位素内标法定量
试剂和材料
除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。10.1试剂
无水乙酸钠（CH:COONa）。
氢氧化钠（NaOH）。
乙酸(CH:COOH)。
乙腈（CH:CN）：色谱纯。
乙酸铵（CH;COONH）：色谱纯。氰化钾或氰化钠（KCN/NaCN）。胃蛋白酶（CAS号：9001-75-6，活力≥400U/mg）。A
10.1.8淀粉酶（活力≥50U/mg）。10.1.9乙醇(CHO)。
10.2试剂配制
10.2.1乙醇溶液（25%）：量取250mL乙醇，加水稀释至1000mL，混匀。GB5009.285—2022
10.2.2乙酸钠缓冲液（0.25mo1/L）：称取20.5g无水乙酸钠，用950mL水溶解并用乙酸调pH至4.0土0.1，用水稀释至1000mL。
10.2.3氰化钾（或氰化钠）溶液（10mg/mL）：称取1.0g氰化钾（或氰化钠）固体，加适量水溶解，并用水稀释至100mL。
注：氰化钾（或氰化钠）为剧毒化学品，操作者须带防护用具，在通风橱内进行氰化钾（或氰化钠）溶液的配制或使用。
氢氧化钠溶液（1mol/L）：称取4.0g氢氧化钠，加适量水溶解，并用水稀释至100mL。10.2.4
10.2.5乙酸铵溶液（2.5mmol/L）：称取0.19g乙酸铵，加适量水溶解，并用水稀释至1000mL。10.2.6乙睛溶液（90%，体积比）：量取100mL水加于900mL乙睛中，混匀，超声脱气。10.3标准品
10.3.1维生素B12（氰钻胺素）标准品（C63H8：CoN14O14P，CAS号：68-19-9）：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。10.3.2维生素B12同位素内标溶液（13Cz-C63H88CoN14O14P）：1μg/mL甲醇溶液。10.4标准溶液配制
10.4.1维生素B12标准储备溶液（1mg/mL）：称取10mg（精确至0.01mg）维生素B12标准品于50mL烧杯中，用乙醇溶液溶解后，转移至10mL容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度，摇匀，转移至棕色试剂瓶，于一20℃下避光保存，有效期6个月。10.4.2维生素B12标准中间溶液（10μg/mL）：吸取1.00mL维生素B12标准储备溶液，置于100mL容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度。转移至棕色试剂瓶中，于4℃下避光保存，有效期1个月。10.4.3维生素B12标准工作溶液（0.2μg/mL）：吸取1.00mL维生素B12标准中间溶液，置于50mL容量瓶中，用水定容至刻度。转移至棕色试剂瓶中，于4℃下避光保存，有效期一周。10.4.4维生素B12同位素内标工作液（50ng/mL）：吸取0.5mL维生素B12同位素内标溶液（1μg/mL），置于10mL容量瓶中，用水定容至刻度。转移至棕色试剂瓶中，于4℃下避光保存。10.4.5标准系列溶液：分别准确移取0.2μg/mL的维生素B12标准工作溶液10μL、25μL、50μL、125L、250uL和500uL于1mL容量瓶中，各加入100uL同位素内标工作液（50ng/mL），用水定容至刻度，摇匀。其中，维生素B12的浓度分别为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL和100ng/mL。维生素B12同位素内标的浓度为5ng/mL。临用现配。10.5材料
10.5.1维生素B12免疫亲和柱，柱容量≥800ng，柱回收率≥85%（验证方法参见附录A）。10.5.2玻璃纤维滤纸。
10.5.3微孔滤膜：水相，0.22um。11仪器和设备
11.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾电离源（ESI）。5
11.2天平：感量为0.01g、0.001g和0.00001g。11.3pH计：精度0.01。
11.4水浴恒温振荡器：温度范围25℃～100℃。11.5超声波清洗器。
11.6离心机：转速≥10000r/min。12分析步骤
注：操作过程应避免紫外光照射，并尽可能避光操作。12.1样品前处理
12.1.1试样制备
GB 5009.285—2022
固体样品需粉碎、研磨，或用绞肉机制成食糜，均质混匀。液体样品测定前振摇混匀。12.1.2提取
12.1.2.1婴幼儿食品和乳品、肉与肉制品、烘焙食品、即食谷物称取混匀后的试样1g～5g（精确至0.01g）于50mL离心管中，依次加入100μL同位素内标工作液、25mL乙酸钠缓冲液、0.04g胃蛋白酶、0.01g淀粉酶和2mL氰化钾（或氰化钠）溶液，充分混合。将样品溶液放人水浴恒温振荡器，在37℃下，振荡酶解30min（肉类样品需酶解10h～16h），酶解后转人100℃水浴中，保持30min，取出冷却至室温。在10000r/min下离心10min，取上清液用玻璃纤维滤纸过滤后备用。
12.1.2.2饮料
称取混勾后的试样25g（精确至0.01g）于50mL离心管中，加人100uL同位素内标工作液，用氢氧化钠溶液调pH至5～7（碳酸饮料需在超声波振荡器中脱气10min后再调pH），在10000r/min下离心10min，取上清液用玻璃纤维滤纸过滤后备用。12.1.2.3果冻
称取混匀后的试样5g（精确至0.01g）于50mL离心管中，加入100μL同位素内标工作液，加人40mL水，涡旋混匀，于70℃水浴中溶解试样，于50℃水浴超声20min，用氢氧化钠溶液调pH至5~7，在10000r/min下离心10min，取上清液用玻璃纤维滤纸过滤后备用。注：对于以氰钴铵素为营养强化剂，且本底中不含有其他形式钴胺素的试样，在样品提取时可不使用氰化钾（或氰化钠）。
12.1.3净化
将免疫亲和柱连接至固相萃取装置上，弃去免疫亲和柱内的缓冲液后，转移全部滤液过柱，调节过柱速度为2mL/min～3mL/min。待样液完全过柱后，用10mL水以稳定流速淋洗免疫亲和柱，抽干。在免疫亲和柱下放置10mL玻璃试管，用3mL甲醇分3次洗脱，收集全部洗脱液，在60℃以下用氮气流缓缓吹至近干，用乙酸铵溶液定容至1.0mL，涡旋30s溶解残留物，0.22uμm滤膜过滤，待测。
注：氰化钾（或氰化钠）废液严禁与酸混合，可加人氢氧化钠调节pH>10，再加入高锰酸钾粉末（按废液质量的3%加人），使氰化物分解，放置24h后排放。6
仪器参考条件
液相色谱参考条件
GB5009.285—2022
色谱柱：C1s柱（柱长100mm，柱内径2.1mm，填料粒径1.7μm），或相当者。流动相：A相，乙酸铵溶液（2.5mmol/L）：B相，乙晴溶液（90%，体积比）。洗脱梯度:0min~0.5min,93% A;0.5 min~2.0 min，93%~85% A;2.0min～2.5 min，12.2.1.3
85%~10%A;2.5 min~3.0 min,10% A;3.0 min~3.5min,10%~93% A;3.5 min~6.0 min,93% A。
流速：0.3mL/min。
柱温：40℃。
进样体积：10μL。
质谱参考条件
电离方式：ESI+。
离子源温度：350℃。
锥孔反吹气流量：50L/h。
脱溶剂气温度：650℃，
脱溶剂气流量：900L/h。
多反应监测（MRM)模式，锥孔电压和碰撞能量见表1，谱图见附录C中图C.1。表1离子对参考条件
化合物名称
维生素Bl2
维生素B12同位素内标
。定量离子。
12.3定性测定
母离子[M+2HJ2+
碎片离子［M+H]+
锥孔电压
碰撞能量
在相同的测试条件下，试样溶液中目标化合物的保留时间与相应标准溶液中目标化合物的保留时间相比，偏差在士2.5%以内，且检测到的离子相对丰度，应当与浓度相当的校正标准溶液相对丰度致，其允许偏差应符合表2的要求。表2定性时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度
允许相对偏差
12.4标准曲线的制作
>20% ~50%
>10% ~ 20%
≤10%
将标准系列溶液由低浓度到高浓度依次注入液相色谱-串联质谱仪中，测定相应的色谱峰面积，以GB5009.285—2022
维生素B12与其同位素内标的峰面积比值为纵坐标，以维生素B12的浓度为横坐标绘制标准曲线，12.5样品测定
将待测样液注人液相色谱-串联质谱仪中，得到待测溶液中维生素B12与其同位素内标的峰面积比值，根据标准曲线得到待测液中维生素B12的浓度。待测液中维生素B12的响应值应在标准曲线的线性范围内，超过线性范围则应减少取样量，重新按样品分析步骤处理后再进样分析12.6空白试验
不称取试样，按样品分析步骤操作，应不含有干扰待测组分的物质。13分析结果的表述
试样中维生素B12（以氰钻胺素计)的含量按式（2)计算：X=pxV×100
m×1000
式中：
试样中维生素B12的含量，单位为微克每百克（ug/100g）；由标准曲线得到的试样溶液中维生素B12的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；试样过柱洗脱液的定容体积，单位为毫升（mL）；换算系数；
试样的取样量，单位为克（g）；换算系数。
计算结果保留两位有效数字。
精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。15其他
·（2）
当取样量为5.00g时，婴幼儿食品和乳品、肉与肉制品、烘焙食品、即食谷物的检出限为0.05μg/100g，定量限为0.2μg/100g。当取样量为25.00g时，饮料的检出限为0.005μg/100g，定量限为0.02μg/100g。当取样量为5.00g时，果冻的检出限为0.03ug/100g，定量限为0.1μg/100g。第三法微生物法
16原理
维生素B12是莱士曼氏乳酸杆菌生长所必需的营养素。在一定条件下，莱士曼氏乳酸杆菌的生长与维生素B12的含量成对应关系。根据维生素B12的含量与透光率（或吸光度值）的标准工作曲线，计算出试样中维生素B12的含量。
17试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。17.1试剂
氯化钠（NaCI）。
无水磷酸氢二钠（Na2HPO4）。
17.1.3无水偏重亚硫酸钠（NazS2Os）。17.1.4
一水合柠檬酸（C6H。O·HO）
氢氧化钠（NaOH)。
17.1.5全
盐酸（HCI）。
乙醇(CHO)。
17.2菌株
莱士曼氏乳酸杆菌（Lactobacillusleichmannii）ATCC7830或等效菌株。17.3标准品
GB5009.285—2022
维生素B12（氰钻胺素）标准品（C63H88CoN14O14P，CAS号：68-19-9）：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。
17.4试剂配制
乙醇溶液（25%）：量取250mL乙醇，加水稀释至1000mL，混匀。17.4.1
17.4.2氯化钠溶液（9g/L）：称取9.0g氯化钠溶于1000mL水中，分装于具塞试管中，每管10mL，121℃灭菌15min。
17.4.3盐酸溶液（1mol/L）：量取90mL盐酸，加水稀释至1000mL，混匀。17.4.4氢氧化钠溶液（1mol/L）：称取40g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1000mL，混匀。17.4.5提取溶液：称取无水磷酸氢二钠1.3g，无水偏重亚硫酸钠1.0g，一水合柠檬酸1.2g，用100mL水溶解。
17.5标准溶液配制
17.5.1维生素B12标准储备液（10μg/mL）：称取10mg（精确至0.01mg）维生素B12标准品于50mL烧杯中，用乙醇溶液溶解后，转移至1000mL容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度，摇勾。转移至棕色试剂瓶中，于一20℃下避光保存，有效期3个月。17.5.2维生素B12中间液（100ng/mL）：准确吸取1.00mL维生素B12标准储备液，置于100mL容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度，摇匀。转移至棕色试剂瓶中，于4℃下避光保存，有效期3个月。17.5.3维生素B12标准工作液（1ng/mL）：准确吸取1.00mL维生素B12标准中间液，置于100mL容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度。临用现配。17.5.4维生素B12标准使用工作液：分别吸取5mL维生素B12标准工作液置于250mL和500mL容量瓶中，用水定容至刻度。高浓度溶液的浓度为0.02ng/mL；低浓度溶液的浓度为0.01ng/mL。临用现配。
17.6培养基bzxZ.net
17.6.1乳酸杆菌琼脂培养基：配制方法见D.1。9
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