本标准规定了食品中叶酸的测定方法。 本标准适用于食品中叶酸的测定。
本标准代替GB 5009.211-2014《食品安全国家标准 食品中叶酸的测定》。
本标准与GB/T 5009.211-2014相比，主要变化如下：
——增加了微孔板测定方法；
——修改了精密度要求；
——修改了附录A。

中华人民共和国国家标准
GB 5009.211—2022
食品安全国家标准
食品中叶酸的测定
2022-06-30发布
中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局
2022-12-30实施
本标准代替GB5009.211—2014《食品安全国家标准本标准与GB5009.211一2014相比，主要变化如下：增加了微孔板测定方法；
修改了精密度要求；
修改了附录A。
食品中叶酸的测定》。
GB5009.211—2022
1范围
食品安全国家标准
食品中叶酸的测定
本标准规定了食品中叶酸的测定方法。本标准适用于食品中叶酸的测定2原理
GB5009.211—2022
叶酸是鼠李糖乳杆菌（Lactobacillusrhamnosus）生长所必需的营养素，在一定控制条件下，将鼠李糖乳杆菌菌按王含有试样可培养基培养测定\（或当座），在一定测定范围内可以村据叶量率·或度，的、“，算十酸今3试剂和材米
除非另有日.4方法T片式齐均于析纯水为3/门6682规的二级力、。3.1试剂
盐酸（HCI）。
氢氧化钠（NaOH)
氯化钠（NaCI）。
十二水合磷酸钠（Nas上
七水合磷酸氢二钠（1，·‘2
L-抗坏血酸（C.H.O）。
甲苯（C,Hg）。
无水乙醇(CHO)。
鸡胰腺冻干粉：含-谷胺酰基水解酶。3.1.10
木瓜蛋白酶：酶活力≥5U/mg。
3.1.11α-淀粉酶：酶活力≥1.5U/mg。3.2i
试剂配制
磷酸盐缓冲液（0.05mo1/L，pH6.8）：分别称取4.35g十二水合磷酸钠和10.39g七水合磷酸氢3.2.1
二钠，加水溶解并定容至1L，混匀。加人2mL甲苯，室温保存。临用前按约5mg/mL的比例加入L-抗坏血酸作为叶酸保护剂，调节pH至6.8士0.1。3.2.220%乙醇溶液（2十8）：量取200mL无水乙醇与800mL水混勾。3.2.3氢氧化钠乙醇溶液（0.01mol/L）：称取0.4g氢氧化钠，用20%乙醇溶液溶解并定容至1L，混匀。
3.2.4氢氧化钠溶液（1mol/L）：称取40g氢氧化钠，加水溶解并定容至1L，混匀。1
GB 5009.211—2022
3.2.5盐酸浸泡液：量取100mL盐酸（浓度36%38%）与50倍水混合。3.2.6鸡胰腺溶液：称取100mg鸡胰腺冻干粉，加人20mL磷酸盐缓冲液，摇匀。现用现配。3.2.7蛋白酶-淀粉酶液：分别称取200mg木瓜蛋白酶和α-淀粉酶，加入20mL磷酸盐缓冲液研磨至匀浆，3000r/min离心5min。现用现配3.3培养基
菌种储备用琼脂培养基：按A.1配制。3.3.2叶酸测定培养基：按A.2配制。注：以上培养基也可用商品化的合成或成品培养基，用前按说明书配制。3.4标准品
叶酸标准品（C19H19N，O6，CAS：59-30-3）：纯度≥97%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。
5标准溶液的配制
3.5.1叶酸标准储备液（20.0ug/mL）：准确称取20.0mg叶酸标准品，用氢氧化钠乙醇溶液溶解，转移并定容至1000mL棕色容量瓶中。将溶液转移至棕色玻璃容器中，于2℃～4℃冰箱避光保存，保存期2年。
3.5.2叶酸标准中间液（0.200uμg/mL）：准确吸取1.00mL叶酸标准储备液置于100mL棕色容量瓶中，用氢氧化钠乙醇溶液稀释并定容至刻度，混匀。将溶液转移至棕色玻璃容器中，于2℃～4℃冰箱避光保存，保存期1年。
3.5.3叶酸标准工作液（0.200ng/mL）：准确吸取1.00mL叶酸标准中间液置于1000mL容量瓶中，用水稀释并定容至刻度，混匀。现用现配。4仪器和设备
天平：感量为0.1mg和1mg。
恒温培养箱：36℃士1℃。
高压灭菌锅。
涡旋振荡器。
离心机：3000r/min。
接种环和接种针。
4.7pH计：精度为士0.1。
组织粉碎机和研磨仪。
紫外-可见分光光度计。
超净工作台。
超声波振荡器。
酶标仪。
离心管。
微孔板（无菌）。
滤膜（0.22μm）。
容量瓶。
注：所用玻璃器具使用前用盐酸浸泡液或月桂基磺酸钠洗涤剂清洗干净后，250℃干热1h～2h5菌种的制备与保存
5.1菌种
鼠李糖乳杆菌Lactobacillusrhamnosus（ATCC7469）或等效菌株。5.2储备菌种的制备
GB 5009.211—2022
将菌种鼠李糖乳杆菌转接至菌种储备用琼脂培养基中，在36℃土1℃恒温培养箱中培养20h～24h，连续传种2代～3代。取出后放人2℃～4℃冰箱作为储备菌株保存实验前将储备菌株接种至菌种储备用琼脂培养基中，在36℃土1℃恒温培养箱中培养20h～24h以活化菌株，用于接种液的制备。注：保存2周以上的储备菌种，不能立即用作接种液制备，实验前宜连续传种2代～3代以保证细菌活力5.3接种液的制备
实验前-八，取）mL.-工mL，用本匀，衣±，支试管中，于121℃（0.10v2a-\2Ma）高，丞菌5i或根弄基标讲行灭自为种子培养液。冷却后用接利将活的言至：文子音养，，=36，℃恒培箱中培养20h～24h。取出后将种子培养液混悬，无菌操作下吸取0.5mL转种至5mL不加叶酸标准工作液的无菌叶酸测定培养基中，丁℃1‘再音养h以肖耗种子培差液中残子在菌叶酸，制成接种液。
6分析步骤（所有操作均需避光讲行）6.1试样制备
谷物类、豆类、乳粉等试样需粉碎、研磨、过筛（筛板孔径0.3mm～05mm）；肉、蛋、坚果等用均质器制成食；果蔬、半固体品·需匀也冻干噪混匀；液体试样用前振摇混合。上述制备的试样于2℃4冰箱余！。6.2试样提取
6.2.1直接提取法
测定样品中添加的叶酸含量时，可采用直接提取法。准确称取固体试样0.1g～2g或液体试样0.5mL～2mL，精确至0.001g，转人锥形瓶中，加人80mL氢氧化钠乙醇溶液，具塞，超声振荡0.5h～4h至试样完全溶解或分散，转人100mL容量瓶中，用水定容至刻度。
6.2.2酶解提取法
谷薯类、肉蛋乳类、果蔬菌藻类、豆类及坚果类等食品试样中天然存在的叶酸宜采用酶解提取法。准确称取适量试样（含0.2ug～2μg叶酸），精确至0.001g。一般谷薯类、肉类、乳类、新鲜果蔬、菌藻类试样2g～5g;蛋类、豆类、坚果类、内脏、干制试样0.2g～2g；流质或半流质试样5g～10g。转人100mL锥形瓶中，加30mL磷酸盐缓冲液，振摇5min后，具塞，于121℃（0.10MPa～0.12MPa)高压水解15min。
试样取出后冷却至室温，加人1mL鸡胰腺溶液、1mL蛋白酶-淀粉酶液，混合。加入3滴～5滴甲5
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苯后，置于36℃士1℃恒温培养箱内酶解16h～20h。取出，转100mL容量瓶，加水定容至刻度，过滤。
另取一只锥形瓶，不加试样，其他步骤同试样操作，作为酶空白液。注：以谷物、乳粉等为基质的配方食品如需计量基质本底叶酸含量，可采用酶解法提取6.3稀释
根据试样中叶酸含量用水对试样提取液进行适当稀释，使试样稀释液中叶酸含量在0.2ng/mL～0.3ng/mL范围内。
6.4试样测定
6.4.1试管法
6.4.1.1试样和酶空白系列管
取3支试管，分别加入1.0mL、2.0mL、3.0mL试样稀释液（V），补水至5.0mL，混匀。另取3支试管同法加人酶空白液。每个梯度做2个平行。6.4.1.2标准系列管
取试管分别加人叶酸标准工作溶液0.00mL、0.25mL、0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL、3.00mL、4.00mL和5.00mL，补水至5.00mL，相当于标准系列管中叶酸含量为0.00ng0.05ng、0.10ng、0.20ng、0.30ng、0.40ng、0.50ng、0.60ng、0.80ng和1.00ng，混匀。制备2套~3套标准系列管，绘制标准曲线时，以每个标准点平均值计算。6.4.1.3灭菌
将所有测定系列管、叶酸测定培养基于121℃（0.10MPa～0.12MPa）高压灭菌15min（或根据培养基要求进行灭菌）。
6.4.1.4接种和培养
待测定系列管冷却至室温后，在无菌操作条件下，每10mL叶酸测定培养基加入接种液40uL，混匀，每支测定管中加人接种后的叶酸测定培养基5mL，混匀。置于36℃士1℃恒温培养箱中培养20h～40h，获最大混浊度时终止培养。另准备一支标准0管（含0.00ng叶酸）不接种作为0对照管6.4.1.5测定
将培养好的标准系列管、试样和酶空白系列管用漩涡振荡器混勾。用1cm比色杯，于540nm处以未接种0对照管调节透光率为100%（或吸光度值为0），依次测定标准系列管、试样和酶空白系列管的透光率（或吸光度值）。如果0对照管出现浑浊，说明可能有杂菌污染，需重做实验。注：适宜的测定光谱范围为540nm～610nm。6.4.2微孔板法
6.4.2.1试样系列管
先将6.3试样稀释液无菌条件下用无菌水相滤膜（0.22um）过滤除菌，取3支1.5mL无菌离心管，分别加入100μL、200μL、300μL试样稀释液，补无菌水至500μL。每个梯度做2个平行。4
6.4.2.2标准系列管
GB5009.211—2022
按6.4.1.2中标准溶液的制备方式，体积按比例缩减至1.0mL后，在无菌条件下过滤除菌至无菌离心管中。制备2套～3套标准系列管，绘制标准曲线时，以每个标准点平均值计算。6.4.2.3接种和培养
叶酸测定培养基高压灭菌冷却后，每10mL培养基中加人菌种接种液40uL，混勾，吸取150uL加入微孔板中。另吸取150μL标准系列管或试样系列管加人微孔板中，覆膜，混匀，置于36℃士1℃恒温培养箱中培养32h40h。
6.4.2.4测定
混匀微孔板中培养物，用酶标仪在540nm处测定吸光度值，如果0对照孔出现浑浊，说明可能有杂菌污染，需重做实验。注：适宜的测定光谱范围为540nm～610nm。7分析结果专长
7.1标准曲线
以标准系列含量示，每板准透光率（或吸光度值均值为制标准曲线。2试样结果·
从标准曲线计算试样或酶穴白系列管中十的机亡、，），加甲试样系列管中有2支叶酸含量在0.10ng～0.80ng范门内.日各管之-台为每毫←样提叶含量的偏差小于10%，则可继续按式（1）、式（2）、式（3进亍结果计半，需重新耳样测定。试样稀释液的叶酸浓度按式(1)计算。（1）
式中：
试样稀释液中叶酸浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；从标准曲线上查得试样系列管中叶酸含量，单位为纳克（ng）；V，一-制备试样系列管时吸取的试样稀释液体积，单位为毫升（mL）。注：微孔板法吸取100μL、200μL和300μL时，对应V分别为1mL、2mL和3mL。采用直接提取法的试样叶酸含量按式（2)计算。X=ixvxf
式中：
试样中叶酸含量，单位为微克每百克（μg/100g）；试样稀释液叶酸浓度平均值，单位为纳克每毫升（ng/mL）；试样提取液定容体积，单位为毫升（mL）；试样提取液稀释倍数；
试样质量，单位为克（g）；
由纳克每克（ng/g）换算为微克每百克（μg/100g）的系数。（2）
GB5009.211—2022
采用酶解提取法的试样叶酸含量按式（3)计算。(×f-c)×V
式中：
co———酶空白液中叶酸浓度平均值，单位为纳克每毫升（ng/mL）；式中X、、f、V、m、1000
的含义同式（2）。
计算结果保留三位有效数字。
注：液体试样叶酸含量也可以微克每百毫升（ug/100mL)为单位。精密度
.......(3)
般食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%；营养素补充剂和强化食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
9其他
试管法：果蔬类试样称样量为5g时，检出限为0.2μg/100g，定量限为0.4μg/100g；蛋白质、淀粉含量高的试样称样量为5g时，检出限为1.0ug/100g，定量限为2.0ug/100g；营养强化剂和强化食品称样量为1g时，检出限为0.5μg/100g，定量限为1.0μg/100g。微孔板法：添加了叶酸的样品，称样量为1.0g，稀释倍数为1时，检出限为0.5μg/100g，定量限为1.0 μg/100g。
菌种储备用琼脂培养基
A.1.1试剂
磷酸氢二钾（K,HPO4）。
附录A
培养基配制
三水合磷酸二氢钾（KHzPO·3H,O）。七水合硫酸镁（MgSO：7HO）
七水合硫酸亚铁（FeSO·7HzO)。一水合硫酸锰（MnSO4·H2O）。三水合乙酸钠（CH:COONa·3Hz)。葡香糕（1112O）。
蛋E豚氮量≥I.
酵提干粉
琼服。
GB5009.211—2022
盐滘、：mol）里.8：m盐骏（36。～38%）水定1)cmL,混匀。试剂配刷
甲盐溶液：分别称取2g磷酸气
混匀。加人1mL甲苯，混；该各极于2℃5g（台磷酸
，℃冰箱可保，1年，
.7.水溶解并定容至500mL，
A.1.2.2乙盐溶液：分别称日1.~+水台硫钅、0.5g录化钠、0.-。、硫酸亚铁和0.5g一水合硫酸锰，加水溶解并定容至500nL。加51m~1/I盐溶液，混勾该溶液于2℃～4℃冰箱可保存1年。
A.1.2.3菌种储备用琼脂培：*表：.1量吸，加·）mL，混合，沸水浴加热至琼脂完全溶化。趁热用1mol/L酸溶液×1uu1.L氧化浴液词节H至6.8士0.1。尽快分装，根据试管内径粗细加人3mL～5mL，液面高度不得低于2cm。121℃（0.10MPa～0.12MPa）高压灭菌15min。试管取出后直立放置，待冷却后于2℃～4℃冰箱内保存，备用。表A.1菌种储备用琼脂培养基配制一览表试剂免费标准下载网bzxz
葡萄糖/g
蛋白陈/g
酵母提取物干粉/g
三水合乙酸钠/g
甲盐溶液/mL
乙盐溶液/mL
琼脂/g
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