本文件规定了超高效液相色谱法测定番茄制品中番茄红素、叶黄素、胡萝卜素含量的原理、试剂和材料、仪器设备、分析步骤、结果计算、精密度、检出限和定量限。

ICS67.080
CCSX10
中华人民共和国国家标准
GB/T41133—2022
番茄制品中番茄红素、叶黄素、胡萝下素含量的测定
超高效液相色谱法
Determination of lycopene,lutein and carotenein tomatoproducts-Ultraperformanceliquidchromatography(UPLC)method2022-03-09发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2022-10-01实施
GB/T41133—2022
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本文件主要起草人：翁史昱、林琳、林毅侃、黄雨晴、张雯、郑翌、葛宇、陈羽菲、孟杰、郑存哲。1
1范围
番茄制品中番茄红素、叶黄素、胡萝卜素含量的测定
超高效液相色谱法
GB/T41133—2022
本文件规定了超高效液相色谱法测定番茄制品中番茄红素、叶黄素、胡萝卜素含量的原理、试剂和材料、仪器设备、分析步骤、结果计算、精密度、检出限和定量限本文件适用于番茄粉、番茄酱、番茄饮料、番茄干制品中番茄红素、叶黄素、α胡萝卜素和β-胡萝卜素的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
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3术语和定义
分析实验室用水规格和试验方法本文件没有需要界定的术语和定义。4原理
试样加人水和乙醇后.用乙醚-正己烷-环己烷混合溶液提取其中的番茄红素、叶黄素、胡萝卜素，超高效液相色谱法分离，紫外检测器或者二极管阵列检测器检测，外标法定量。试剂和材料
除非另有规定，仅使用色谱纯试剂。5.1
水：GB/T6682.一级。
5.2环已烷（C,H）。
乙醚［（C,H），O]。
正已烷（C,Hu）。
无水乙醇（C.H，OH)：分析纯。三丁基羟基甲苯(CisH2O,BHT)：分析纯。甲醇（CH，OH)。
二氯甲烷（CH,CI，）。
萃取溶剂：用分析天平（6.3）称取1.0gBHT（5.6），以400mL正已烷（5.4）溶解，加入200mL环已1
GB/T41133—2022
烷（5.2）和400mL乙醚（5.3），混匀。5.100.1%BHT和二氯甲烷溶液：用分析天平（6.3）称取1.0gBHT（5.6），加人1000mL二氯甲烷（5.8)混匀。
5.110.1%BHT、乙醇和二氯甲烷溶液：用分析天平（6.3）称取1.0gBHT（5.6）.以900mL乙醇（5.5）溶解，加100mL二氯甲烷（5.8），混匀。5.12番茄红素标准物质（CHs6，CAS号：502-65-8）：纯度大于或等于98%。5.13叶黄素标准物质（CHsO2，CAS号：127-40-2）：纯度大于或等于98%。5.14α-胡萝卜素标准物质（CHs.CAS号：7488-99-5）：纯度大于或等于98%。5.15β-胡萝卜素标准物质（C4Hs6，CAS号：7235-40-7)：纯度大于或等于98%。5.16番茄红素储备液（50ug/mL）：用分析天平（6.3）准确称取5mg（精确至0.01mg）番茄红素（5.12），以0.1%BHT和二氯甲烧溶液（5.10）溶解并定容至100mL。该标准储备液应充氮避光置于一20℃或以下的冰箱中保存，有效期3个月。番茄红素标准储备液使用前应按附录A的规定校正。5.17叶黄素储备液（50μg/mL）：用分析天平（6.3）准确称取5mg（精确至0.01mg）叶黄素（5.13），以0.1%BHT和二氯甲烷溶液（5.10）溶解并定容至100mL。该标准储备液应充氮避光置于一20℃或以下的冰箱中保存，有效期6个月。叶黄素标准储备液使用前应按附录A的规定校正。5.18α-胡萝卜素储备液（50μg/mL）：用分析天平（6.3）准确称取5mg（精确至0.01mg）α-胡萝卜素（5.14).以0.1%BHT和二氯甲烷溶液（5.10）溶解并定容至100mL。该标准储备液应充氮避光置于一20℃或以下的冰箱中保存，有效期6个月。α-胡萝卜素标准储备液使用前应按附录A的规定校正。
5.19β-胡萝下素储备液（50μg/mL）：用分析天平（6.3）准确称取5mg（精确至0.01mg）β-胡萝卜下素（5.15），以0.1%BHT和二氯甲烷溶液（5.10）溶解并定容至100mL。该标准储备液应充氮避光置于一20℃或以下的冰箱中保存，有效期6个月。β-胡萝卜素标准储备液使用前应按附录A的规定校正。
5.20混合标准工作液：分别从番茄红素储备液（5.16）、叶黄素储备液（5.17）、α-胡萝卜素储备液（5.18）和β-胡萝下素储备液（5.19）中各准确移取0.050mL、0.100mL0.200mL、0.400mL、1.00mL溶液于5个25mL棕色容量瓶中，用0.1%BHT、乙醇和二氯甲烷溶液（5.11）定容至刻度，得到质量浓度为0.100μg/mL0.200μg/mL、0.400μg/mL、0.800pg/mL、2.00μg/mL的系列混合标准工作液。临用前配制。
5.21中性氧化铝固相萃取小柱：500mg/3mL，使用前用5mL萃取溶剂（5.9）淋洗，保持柱体湿润5.220.22μm滤膜：有机系。
仪器设备
超高效液相色谱仪：配有二元及以上梯度泵，带二极管阵列检测器或紫外检测器。6.2
紫外分光光度计。
6.3分析天平：感量为0.01mg和0.01g。6.4
组织捣碎机。
6.5涡旋振荡器。
减压浓缩装置。
固相萃取装置。
离心机：转速不低于5000r/min。7试验步骤
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除非另行说明，所有试验操作应在500nm以下紫外光的黄色光源或红色光源环境中进行：提取过程应在通风柜中操作。
样品前处理
试样制备
取一定数量的有代表性的样品，块状或颗粒状样品用组织捣碎机（6.4）粉碎，粉末状、糊状或液体样品充分混勾后，储存于样品瓶中。制备好的试样应充氮密封后置于一20℃或以下的冰箱中保存。试样提取
用分析天平（6.3）称取5g（精确到0.01g）试样（7.2.1）于50mL聚丙烯离心管中.加人10mL水（5.1），混匀，加人10mL无水乙醇（5.5），15mL萃取溶剂（5.9）于避光条件下用涡旋振荡器（6.5）提取3min后，用离心机（6.8）5000r/min离心3min，吸取上清液于另一50mL聚丙烯离心管中，在原离心管中加人15mL萃取溶剂（5.9）再次萃取，重复提取2次，合并提取液，用减压浓缩装置（6.6）在室温下浓缩至近干，在涡旋振荡器（6.5）上用5mL萃取溶剂（5.9）溶解残渣，待净化。7.2.3
试样净化
于固相萃取装置（6.7）中将提取液（7.2.2）以约1mL/min的流速过已活化的中性氧化铝固相萃取小柱（5.21）.用5mL萃取溶剂（5.9）洗脱，合并流出液与洗脱液，用减压浓缩装置（6.6）在室温下浓缩至近干，在涡旋振荡器（6.5）上用2mL0.1%BHT、乙醇和二氯甲烷溶液（5.11）溶解残渣，过0.22μm滤膜（5.22)，待用。
超高效液相色谱条件
超高效液相色谱仪（6.1)的色谱条件如下：a)
色谱柱：多环芳烃分析用C色谱柱：1.8μm，100mm×2.1mm（内径）；流动相A：甲醇（5.7）十二氯甲烷（5.8）（97：3）；流动相B：水（5.1），洗脱梯度应符合表1的规定；
柱温：30℃；
流速：0.4mL/min；
进样量：2μL；
检测波长：450nm。
注：由于测试设备的多样性，色谱条件可依超高效液相色谱仪的型号作相应调整。表1
多环芳烃分析用C18色谱柱-超高效液相色谱法洗脱梯度条件流速
mL/min
流动相A
流动相B
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多环芳烃分析用C18色谱柱-超高效液相色谱法洗脱梯度条件（续）时间
标准曲线的制作
mL/min
流动相A
流动相B
按照7.3测试条件，将混合标准工作液（5.20）注入超高效液相色谱仪（6.1）中进行测试，测定相应的峰面积，以混合标准工作液（5.20）的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。7.5试样溶液的测定
按照7.3测试条件，将待测样品溶液（7.2.3）注人超高效液相色谱仪（6.1）中进行测试。待测样品溶液中目标物质的响应值应在仪器线性相应范围内，否则应适当稀释。混合标准工作液（5.20）与待测样液等体积进样。根据标准溶液色谱峰的保留时间和峰面积，对试样溶液的色谱峰根据保留时间进行定性，外标法定量。番茄红素、叶黄素、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素混合标准色谱图见附录B。8
结果计算
试样中组分（番茄红素、叶黄素、α-胡萝下素、β-胡萝下素）的含量X，的计算按式（1）进行：X,=pvf
式中：
试样中各组分的含量，单位为微克每百克（ug/100g）；.（1)
从标准工作曲线得到的试样溶液中各组分的质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；样品定容体积，单位为毫升（mL）：稀释倍数：
试样的取样量，单位为克（g）；换算系数。
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，保留3位有效数字。精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。10
检出限和定量限
本文件的检出限：当取样量为5g、定容体积为2mL时，叶黄素的检出限为1μg/100g，番茄红素、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素的检出限均为0.6μg/100 g。GB/T41133—2022
本文件的定量限：当取样量为5g、定容体积为2mL时，叶黄素的定量限为3μg/100g，番茄红素α-胡萝卜素和β-胡萝卜素的定量限均为2.0ug/100g。5
GB/T41133—2022
试验步骤
附录A
（规范性）
标准溶液浓度的校正
使用前，应对番茄红素、叶黄素、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素标准溶液的浓度进行校正。分别取番茄红素α-胡萝卜素和β-胡萝卜素标准储备液100μL于10mL棕色容量瓶中，用正已烷（5.4）定容至刻度，混匀，用1cm石英比色杯，以正已烷（5.4）为空白参比，用紫外分光光度计（6.2）按表A.1的测定波长测定其吸光度。
取叶黄素标准储备液100L于10mL棕色容量瓶中，用乙醇（5.5）定容至刻度，混匀，用1cm石英比色杯，以乙醇（5.5）为空白参比，用紫外分光光度计（6.2）按表A.1的测定波长测定其吸光度表A.1
目标物
番茄红素
叶黄素
a-胡萝卜素
β-胡萝下素
结果计算
各类胡萝素测定波长及百分吸光系数测定波长
按式（A.1)计算标准溶液质量浓度：p
式中：
X10000x100
标准溶液质量浓度，单位为微克每毫升（ug/mL)；标准溶液吸光值；
1%比色吸光系数E
..(A.1)
1%比色吸光系数（各类胡萝卜素相应的比色吸光系数见表A.1)；换算系数；
稀释倍数。
附录B
（资料性）
番茄红素、叶黄素、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素混合标准色谱图GB/T41133—2022
番茄红素、叶黄素、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素混合标准溶液超高效液相色谱图见图B.1。281
nyu/各
标引序号说明：
1—叶黄素：
2——α-胡萝卜素；
3β-胡萝下素，
4—番茄红素。
时间/min
番茄红素、叶黄素、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素混合标准色谱图20.0
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