GB/T 35956-2018/ISO 15819:2014
基本信息
标准号： GB/T 35956-2018/ISO 15819:2014
中文名称：化妆品中N-亚硝基二乙醇胺(NDELA)的测定高效液相色谱-串联质谱法
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
下载大小：5247651
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
GB/T 35956-2018/ISO 15819:2014.Detection and determination of N-nitrosodiethanolamine (NDELA) in cosmetics- -HPLC-MS-MS.
GB/T 35956描述一种方法,用于检测和定量测定化妆及其原料中的NDELA.此方法不适用于检测和/或定量测定NDELA以外的亚硝基胺类化合物，也不适用于测定化妆品及其原料以外产品中的NDELA.如果一个产品有可能受到来自其原料的NDELA污染或由其原料而生成NDELA,那么,本标准方法应被用来定量测定NDELA.本方法不用于化妆品的常规测定。因为在应用范围内有许多类别的化妆品,故本方法对于某些基质,可能需要有个采纳、改编的过程(参考ISO12787)。因此,正在分:别开发其他的国际标准,这些标准将适用于测定化妆品中的其他亚硝基胺类物质。如果其他的测定方法在回收率和定量上能被证明适合测定NDELA,那么这些方法也可以使用。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
ISO 3696:1987分析实验室用水 规格和试验方法( Water for analytical laboratory use- Speci-fication and test methods)IsO 12787:2011化妆品 分析方法 使用 色谱技术对分析结果的确认准则(Cosmetics- Analytical methods- Validation criteria for analytical results using chromatographic techniques)
3原理
在氘代d8-NDELA内标物存在情况下,用水提取出化妆品样品中的NDELA.净化步骤可以采用C18装载的固相萃取小柱(固相萃取净化，见6.3.1),或当样品在水中不分散时,可采用二氯甲烷液液萃取(DCM净化,见6.3.2)。提取物采用HPLC-MS-MS分析(高效液相色谱串联质谱检测)。利用分子离子和两个特征离子来鉴定NDELA。通过比较在标准曲线上NDELA和d8-NDELA的主要碎片离子的比例来定量NDELA.
根据ISO12787,可以用第二个分析来确证样品中不存在NDELA.在目标值处的标准添加法可以用来评估样品中NDELA的检测限。
对于特定的化妆品,如果发现其基体效应对本检测方法的实施有显著的影响(灵敏度.准确度等)，则可以采用标准添加校准程序(参考ISO 12787)。
在分析试验中,除非另有说明,仅使用分析纯试剂和蒸馏水或符合IsO 3696;1987标准的1级水。溶剂应具有适合HPLC-MS的品质。
GB/T 35956描述一种方法,用于检测和定量测定化妆及其原料中的NDELA.此方法不适用于检测和/或定量测定NDELA以外的亚硝基胺类化合物，也不适用于测定化妆品及其原料以外产品中的NDELA.如果一个产品有可能受到来自其原料的NDELA污染或由其原料而生成NDELA,那么,本标准方法应被用来定量测定NDELA.本方法不用于化妆品的常规测定。因为在应用范围内有许多类别的化妆品,故本方法对于某些基质,可能需要有个采纳、改编的过程(参考ISO12787)。因此,正在分:别开发其他的国际标准,这些标准将适用于测定化妆品中的其他亚硝基胺类物质。如果其他的测定方法在回收率和定量上能被证明适合测定NDELA,那么这些方法也可以使用。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
ISO 3696:1987分析实验室用水 规格和试验方法( Water for analytical laboratory use- Speci-fication and test methods)IsO 12787:2011化妆品 分析方法 使用 色谱技术对分析结果的确认准则(Cosmetics- Analytical methods- Validation criteria for analytical results using chromatographic techniques)
3原理
在氘代d8-NDELA内标物存在情况下,用水提取出化妆品样品中的NDELA.净化步骤可以采用C18装载的固相萃取小柱(固相萃取净化，见6.3.1),或当样品在水中不分散时,可采用二氯甲烷液液萃取(DCM净化,见6.3.2)。提取物采用HPLC-MS-MS分析(高效液相色谱串联质谱检测)。利用分子离子和两个特征离子来鉴定NDELA。通过比较在标准曲线上NDELA和d8-NDELA的主要碎片离子的比例来定量NDELA.
根据ISO12787,可以用第二个分析来确证样品中不存在NDELA.在目标值处的标准添加法可以用来评估样品中NDELA的检测限。
对于特定的化妆品,如果发现其基体效应对本检测方法的实施有显著的影响(灵敏度.准确度等)，则可以采用标准添加校准程序(参考ISO 12787)。
在分析试验中,除非另有说明,仅使用分析纯试剂和蒸馏水或符合IsO 3696;1987标准的1级水。溶剂应具有适合HPLC-MS的品质。
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标准内容
ICS71.100.70
中华人民共和国国家标准
GB/T35956—2018/ISO15819:2014化妆品中N-亚硝基二乙醇胺（NDELA)的测定
高效液相色谱-串联质谱法
Detection and determination of N-nitrosodiethanolamine (NDELA) incosmeticsHPLC-MS-MS
[ISO15819:2014,Cosmetics—Analytical methods—Nitrosamines:Detection and determination of N-nitrosodiethanolamine (NDELA) incosmetics by HPLC-MS-MS,IDTJ2018-02-06发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2018-09-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。GB/T35956—2018/ISO15819:2014本标准使用翻译法等同采用ISO15819：2014《化妆品分析方法化妆品中N-亚硝基二乙醇胺（NDELA)的测定高效液相色谱-串联质谱法》（英文版）。本标准做了下列编辑性修改：
将标准名称修改为《化妆品中N-亚硝基二乙醇胺（NDELA）的测定a
高效液相色谱-串联质谱
法》；
删除国际标准的前言和引言；
c）增加资料性附录NA。
本标准由中国轻工业联合会提出。本标准由全国香料香精化妆品标准化技术委员会（SAC/TC257)归口。本标准起草单位：上海市日用化学工业研究所、江苏省产品质量监督检验研究院（国家化妆品质量监督检验中心）、北京宝洁技术有限公司。本标准主要起草人：徐清皓、金其璋、蒋燕、卢剑。1范围
GB/T35956-—2018/ISO15819:2014化妆品中N-亚硝基二乙醇胺（NDELA）的测定高效液相色谱-串联质谱法
本标准描述一种方法，用于检测和定量测定化妆及其原料中的NDELA。此方法不适用于检测和/或定量测定NDELA以外的亚硝基胺类化合物，也不适用丁测定化妆品及其原料以外产品中的NDELA。如果一个产品有可能受到来自其原料的NDELA污染或由其原料而生成NDELA，那么，本标准方法应被用来定量测定NDEI.A。本方法不用于化妆品的常规测定。因为在应用范围内有许多类别的化妆品，故本方法对于某些基质，可能需要有个采纳、改编的过程（参考ISO12787）。因此，正在分别开发其他的国际标准，这些标准将适用于测定化妆品中的其他亚硝基胺类物质。如果其他的测定方法在回收率和定量上能被证明适合测定NDELA，那么这些方法也可以使用。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ISO3696：1987分析实验室用水规格和试验方法（Waterforanalyticallaboratoryuse—Specification and testmethods)
ISO12787：2011化妆品分析方法使用色谱技术对分析结果的确认准则（CosmeticsAnalytical methodsValidation criteria for analytical results using chromatographic techniques)3原理
在尔代d8-NDELA内标物存在情况下，用水提取出化妆品样品中的NDELA。净化步骤可以采用C1：装载的固相苯取小柱（固相萃取净化，见6.3.1），或当样品在水中不分散时，可采用二氯甲烷液-液萃取（DCM净化，见6.3.2）。提取物采用HPLC-MS-MS分析（高效液相色谱串联质谱检测）。利用分子离子和两个特征离子来鉴定NDELA。通过比较在标准曲线上NDELA和d8-NDELA的主要碎片离子的比例来定量NDELA。根据ISO12787，可以用第二个分析来确证样品中不存在NDELA。在目标值处的标准添加法可以用来评估样品中NDELA的检测限。对于特定的化妆品，如果发现其基体效应对本检测方法的实施有显著的影响（灵敏度、准确度等），则可以采用标准添加校准程序（参考ISO12787）。4试剂
在分析试验中，除非另有说明，仅使用分析纯试剂和蒸馏水或符合ISO3696：1987标准的1级水。溶剂应具有适合HPLC-MS的品质。4.1甲醇，HPLC-MS级。
4.2乙醇，HPLC-MS级。
-TTKAOIKAca
GB/T35956—2018/ISO15819:20144.3二氯甲烷，HPLC-MS级。
4.4N-亚硝基二乙醇胺，纯度高于95%。N-业硝基二乙醇胺标准物质信息参见附录NA中的表NA.1.
4.5氛代d8-N-亚硝基二乙醇胺，纯度高于95%。4.6醋酸铵，分析纯（适合HPIL.C-MS）。4.71mo1/L醋酸铵溶液，77.08g醋酸铵溶于1.0L水。4.8洗脱液A：2mmol醋酸铵水溶液，取2ml.1mol/L.醋酸铵溶液（4.7)，用水定容至1L。4.9洗脱液B:2mmol醋酸铵甲醇水溶液（甲醇与水体积比为9：1）,取2mL1mol/L醋酸铵溶液（4.7），用9：1（体积比）甲醇水溶液定容至1L。5仪器
使用标准实验室玻离仪器和设备，外加以下设备：5.1涡旋混合器
5.2样品处理站SPE位用中的样品处理站（如Vacmaster）。机（最佳为20000G）。
5.3高速离心
注：如果使用离
心速度低手2古的商心机·要注点在SPE净化过程中可能发生的堵塞问题
如有必要，可增
m孔径的膜过滤器的过滤步骤
5.4固相萃
取小柱，例如Bakerband
（平均直径
5.5高效液相色谱申联质谱设备
mL，500mg皮相十八烷基硅烷键合到硅胶上，40APD高效妆液相色谱仪，包拆洗脱液储存器进样系统数据处理
接到利用电喷雾离子化的电联质谱仪上
5.5.2分析用反相高效液相色谱分离机分离柱
球形粒子大小：
保护柱
长度：
内径：
球形粒子大小：
如Spherrsorb
21mm~3.0mm；
5um。
如带有绘图器的积分仪，连
ODSIL配有保护柱，柱尺寸如下：可以选择是否使用保护柱。如果使用，它的内径最好与分高柱的内径相同。宜根据分析反相高效液相色谱分离柱的品牌调整使用条件。6样品制备与储存
6.1综述
警告：大多数N-亚硝胺是强致癌物质，为避免人体接触，应采取所有可能的预防措施1）Bakerbond和Vacmaster是适合本实验的商业化产晶例子，给出该信息是为了方便使用本方法的用户，它并不表示ISO对本产品的担保。
2）Spherisorb是适合本实验的商业化产品例子，给出该信息是为了方便使用本方法的用户，它并不表示ISO对本产品的担保。
iKoNiKAca
GB/T35956-—2018/ISO15819:2014拿取N-亚硝胺或其溶液的所有操作宜在通风充分的通风厨或手套式操作箱内进行。常用的橡胶外科手套不能提供彻底的防护，因此不能长期穿戴，在使用后宜立即脱下并处置。安全处置任何含有N-亚硝胺的溶液（例如使用处置有害化学废料的罐头或提桶）。NDELA应在2℃～8C环境下避光保存。紫外线会使NDELA降解，因此溶液（包括标准溶液和提取液）在储存中应采取措施防止变质和组分改变。
样品萃取后，通常宜在30min内进行HPLC-MS-MS分析。如果分析延迟，建议验证其稳定性。6.2标准溶液制备
6.2.1精确配制大约含有1.0mg/mLNDELA的乙醇储备液A，避光、低于一18C保存。记录精确浓度。
6.2.2精确配制大约含有1.0mg/mLd8一NDELA的乙醇储备液d8A，避光、低于一18℃保存。记录精确浓度
6.2.3用连续稀释储备液A法，制备工作溶液（B、C、D、E、F）。所有溶液应在2℃～8C环境下避光保存。
工作溶液
工作溶液B
工作溶液C
工作溶液D
工作溶液E
工作溶液F
储备液或工作溶液体积
100μL储备液A
100uL工作溶液B
100μL工作溶液C
100工作溶液D
100μL工作溶液E
水体积
900μL
900μL
900μL
900μL
900μL
注：只要最终浓度是可靠的，则使用者可以确定用于制备的实际体积、最终浓度
100.0μg/ml
10.0μg/mL
1.0μg/mL
100.0ng/ml
10.0ng/mL
稳定期
6.2.4用连续稀释储备液（d8A）法，制备d8工作溶液（d8B和d8C），所有溶液应在2℃～8℃环境下避光保存。
工作溶液
工作溶液d8B
工作溶液d8C
储备液或工作溶液体积
20储备液d8A
200μL工作溶液d8B
水体积
1800μL
注：只要最终浓度是可靠的，则使用者可以确定用于制备的实际体积。最终浓度
1.0μg/ml
100.0ng/mL
稳定期
6.2.5稀释工作溶液以制备标准溶液。利用下表7个标准溶液中至少5个标准溶液，制成1.0ng/mL～80.0ng/mL的标准曲线。对应于所要求的定量限（或下限）的标准溶液宜被包括在内。每个溶液中所有溶液应在2℃～8℃环境下避光保存。内标物d8-NDELA的浓度为20ng/mL。标准溶液
标准溶液1
标准溶液2
标准溶液3
工作溶液体积
工作溶液E
工作溶液E
200μL
工作溶液E
工作溶液
d8c体积
200μL
200μL
200μL
400μL
最终浓度
80.0ng/mL
40.0ng/mL
20.0ng/mL
d8-NDELA
20.0ng/mL
20.0ng/ml
20.0ng/ml
稳定期
-irKAoNiKAca
GB/T35956—2018/ISO15819:2014标准溶液
标准溶液4
标准溶液5
标准溶液6
标准溶液7
工作溶液体积
100μL
工作溶液E
工作溶液F
250μL
工作溶液F
100 μL
工作溶液子
工作溶液
d8C体积
200μL
（续）
700μL
300μL
550μL
700μL
最终浓度
10.0ng/mL
d8-NDELA
20.0ng/mL
20.0ng/ml
20.0ng/mL
注1：为了使可
能的基质效应最小化，标准曲线和样品制备可根据仪器灵敏度调整注2：只要最餐浓度是可靠的，则使用者可以确定用于制备的实际体积。6.3
样品制备
6.3.1SPE争化
精确称取丝
为1.0g样品（记录精功质量数
动15min此为样品提取液，如有必要，可尽量减少超声
超声和
的d8B
稳定期
作溶液，用水定容至20.0mL。摇高心10m为避免亚硝胺进
步产生，宜
注：为减少因基质组分共洗脱所造成的电离抑制问题，在主HPLCMS-MS灵域度充作的情况下可以采用较少的样品量和/或较大的初始水体和，改变水的体积时，应保持标准液和样品液内标物的浓度法执行正确的计算。
致，除非无
Cis固相举取小柱以大约3.0mL/mn流速依次用3.0ml甲醇3.0mL水活化。注意不要使柱子
千透。
收集之后大约2mL
取大约5mL样品提取液装入上述Ci固相萃取小柱中，弃去前3mL流出液。的流出液（流速约为3.0mL/min）于小瓶中。如果需要，平行制备三份样品。6.3.2
在水中不分散的样品的另一种样品制备方法（二氢甲净法化）精确称取约0.2g样品（记录精确质量数）于离心管中，加人800uL的d8C工作溶液，摇动1min。加人4mL二氯甲烷，摇动1min。加人3.2mL水，摇动5min。注：为减少因基质组分共洗脱所造成的电离抑制问题，在HPLC-MS-MS灵敏度允许的情况下，可以采用较少的样品量和/或较大的初始水体积。当改变水的体积时，应保持标准溶液和样品溶液中内标物的浓度一致，除非无法执行正确的计算。
以尽可能高的速度离心（理想的为20000G)5min。取上层部分水溶液用于色谱分析。如有必要，用合适的过滤器过滤收集液。如果需要，平行制备三份样品。6.3.3进一步稀释样品液和标准溶液（可选）为尽可能减少基质组分共洗脱所产生的潜在影响（这种影响会抑制NDELA离子化，限制方法的灵敏度），建议对样品提取液和相应的标准溶液进行另外的稀释。用水稀释样品提取液和标准水溶液至灵4
iKAoNiKAca
敏度能适合所应用的特定HPLC-MS-MS系统。6.3.4样品储存
如有必要，样品可低于8℃环境下避光储存。检测步骤
GB/T35956—2018/ISO15819:2014上述两种样品制备方法，最终提取液都是用HIPLCMS-MS分析NDELA。7.2
色谱条件
流动相：洗脱液A
洗脱液
梯度：
时间间隔/m
流速：0.4ml/min。
进样量：20ul
柱温：30
2mmgl醋酸铵水溶液（4.8）
2mmol醋酸铵（体积比=90：10）甲醇水溶液（49）洗脱液A/%
8℃避光推
样品储存：
洗脱液皮%
样品运行：每次运行包括至少5个标准曲线点，每15个样品提取液至少有一个对照样（一个标准溶液）（如果样品量少于15个，至少要带一个对照样）。允许运行至少20个样品提取液，如果证明有足够的托盘稳定性，可以有更大的运行数目。对于某些被确证的基质，液相色谱条件可能需要调整。（见IS012787）HPLC-MS-MS条件
电喷雾，正离子模式。
以三重四极杆质谱仪为例（如ABSciex55003)）给出适当的参数：源设置
离子喷雾电压（ISV)）
去簇电压（DP）
源温度（TEM）
雾化器气（GS1）
涡轮气（GS2）此内容来自标准下载网
650℃
70units（氮气）
70units（氮气）
3）ABSciex5500是适合本实验的商业化产品例子，参数设置取决于所用液相色谱串联质谱系统。给出该信息是为了方便使用本方法的用户，它并不表示ISO对本产品的担保。5
TiKANKAca
GB/T35956—2018/ISO15819:2014气帘气（CUR）
分析器设置
扫描模式
Q1分辨率
Q3分辨率
碰撞活化解离气体（CAD）
30units（氮气）
多反应监测（MRM)对（NDELA用两个选择反应监测，对内标物用一个选择反应监测）
12unit（氨气）
特征离子135（M+H），104和74（碎片离子）鉴定样品中存在NDELA。通过NDELA的两个主要碎片离子104（来自NDELA）和111[来自d8-NDELA的143（M+H)的离子峰强度比率来定量NDELA。
8结果计算
8.1R值的测定
对每次进样（包括校准曲线点，样品提取液和对照样），测定R值，R值被定义为NDELA（M+H）离了的碎片离子104和d8-NDELA（M+H）离子的碎片离子111的离子峰强度比率。（见例，图A.2）。这些R值被用来确定校准曲线和浓度c（如8.4中所示）。8.2校准曲线
以标准溶液中NDELA的浓度对R值作图，得到校准曲线。用于定量测定的校准曲线，其相关系数应大于或等于0.990（见例图A，1）。8.3有效性检查程序及其标准
在相同实验条件下测定校准标准溶液和样品溶液，样品溶液两个监测离子（104和74)的相对强度（以最强离子强度百分比计），应与校准标准溶液的这两个监测离子的相对强度相符，二者容差应符合表1。
通过测试已加人检测限以上浓度的NDELA样品，核对检测方法的有效性。表1相对离子强度的最大允许偏差相对离子强度
（相对于基础离子强度的百分数）>50%
>20%～50%
>10%~20%
≤10%
8.4浓度计算
允许的相对偏差
利用R值测定被提取样品的浓度c（ng/mL），直接从校准曲线上读出浓度。用式（1）计算未知样品的NDELA浓度：W=cXV/m
TiKAONrKAca
式中：
GB/T35956—2018/IS015819:2014每克化妆品样品中NDELA质量分数，单位为纳克每克（ng/g）；提取液中NDELA浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；化妆品样品称取质量，单位为克（g）)；化妆品稀释体积，单位为毫升（mL）（例如，用于SPE净化是20mL，用于二氯甲烷净化是4mL).
注：倘若利用不同体积，那么V值可以调整（见6.3.1和6.3.2中的注）。9
检测报告
检测报告应至少包括以下信息：a)
识别样品的所有必要信息：
识别进行测试的实验室的所有必要信息；本标准的参考文献，
取样形式和日期（如果知道）；实验室收到样品的日期
测试期
g）结果和结果的表达中位
采用的净化方法；
任何检测过程中发现的特殊
可能影响结果的本力法中
指明的任何操作或选用的操作；k）报告负责人的身份及金
TKAoNIKAca
GB/T35956—2018/ISO15819:201414
说明：
（资料性附录）
校准曲线和色谱图示例
标准溶液中NDELA浓度（ng/mL）；R值。
NDELA校准曲线的示例
SRM=m/=1351041.51
面积：26191cps
0.60.8101.2
1.41.61.82.02.22.4
时间/min
GB/T35956—2018/ISO15819:2014SRM=m= 135+74
面积：20815cps
0.60.81.01.2
141.61.82.02.22.4
时间/min
SRM-m=143-111 1.47
面积：164273cps
0.60.81.01.2
1.41.61.82.02.22.4
时间/min
HPLC-MS-MS色谱示例
由分析1.0ng/mL校准溶液获得，该浓度对应于基质中含有NDELA20ng/g。数据获得方法：采用ABSciex5500三重四极杆质谱仪分析，对样品的水提取物再用水稀释4倍。NDELA（定量选择离子反应监测SRM)，上右图：NDELA（第二个选择离子反应监测SRM)；下图：d8-NDELA（内标液选择离子反应监测SRM)。
GB/T35956—2018/IS015819.2014附录NA
（资料性附录）
N-亚硝基二乙醇胺标准物质信息表NA.1N-亚硝基二乙醇胺中文名称、英文名称、英文缩写、CAS号、分子式、相对分子质量及结构式序号
中文名称
N-亚硝基
二乙醇胺
英文名称
N-nitrosodiethanolamine
英文缩写
CAS号
1116-54-7
分子式
相对分
子质量
结构式
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中华人民共和国国家标准
GB/T35956—2018/ISO15819:2014化妆品中N-亚硝基二乙醇胺（NDELA)的测定
高效液相色谱-串联质谱法
Detection and determination of N-nitrosodiethanolamine (NDELA) incosmeticsHPLC-MS-MS
[ISO15819:2014,Cosmetics—Analytical methods—Nitrosamines:Detection and determination of N-nitrosodiethanolamine (NDELA) incosmetics by HPLC-MS-MS,IDTJ2018-02-06发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2018-09-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。GB/T35956—2018/ISO15819:2014本标准使用翻译法等同采用ISO15819：2014《化妆品分析方法化妆品中N-亚硝基二乙醇胺（NDELA)的测定高效液相色谱-串联质谱法》（英文版）。本标准做了下列编辑性修改：
将标准名称修改为《化妆品中N-亚硝基二乙醇胺（NDELA）的测定a
高效液相色谱-串联质谱
法》；
删除国际标准的前言和引言；
c）增加资料性附录NA。
本标准由中国轻工业联合会提出。本标准由全国香料香精化妆品标准化技术委员会（SAC/TC257)归口。本标准起草单位：上海市日用化学工业研究所、江苏省产品质量监督检验研究院（国家化妆品质量监督检验中心）、北京宝洁技术有限公司。本标准主要起草人：徐清皓、金其璋、蒋燕、卢剑。1范围
GB/T35956-—2018/ISO15819:2014化妆品中N-亚硝基二乙醇胺（NDELA）的测定高效液相色谱-串联质谱法
本标准描述一种方法，用于检测和定量测定化妆及其原料中的NDELA。此方法不适用于检测和/或定量测定NDELA以外的亚硝基胺类化合物，也不适用丁测定化妆品及其原料以外产品中的NDELA。如果一个产品有可能受到来自其原料的NDELA污染或由其原料而生成NDELA，那么，本标准方法应被用来定量测定NDEI.A。本方法不用于化妆品的常规测定。因为在应用范围内有许多类别的化妆品，故本方法对于某些基质，可能需要有个采纳、改编的过程（参考ISO12787）。因此，正在分别开发其他的国际标准，这些标准将适用于测定化妆品中的其他亚硝基胺类物质。如果其他的测定方法在回收率和定量上能被证明适合测定NDELA，那么这些方法也可以使用。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ISO3696：1987分析实验室用水规格和试验方法（Waterforanalyticallaboratoryuse—Specification and testmethods)
ISO12787：2011化妆品分析方法使用色谱技术对分析结果的确认准则（CosmeticsAnalytical methodsValidation criteria for analytical results using chromatographic techniques)3原理
在尔代d8-NDELA内标物存在情况下，用水提取出化妆品样品中的NDELA。净化步骤可以采用C1：装载的固相苯取小柱（固相萃取净化，见6.3.1），或当样品在水中不分散时，可采用二氯甲烷液-液萃取（DCM净化，见6.3.2）。提取物采用HPLC-MS-MS分析（高效液相色谱串联质谱检测）。利用分子离子和两个特征离子来鉴定NDELA。通过比较在标准曲线上NDELA和d8-NDELA的主要碎片离子的比例来定量NDELA。根据ISO12787，可以用第二个分析来确证样品中不存在NDELA。在目标值处的标准添加法可以用来评估样品中NDELA的检测限。对于特定的化妆品，如果发现其基体效应对本检测方法的实施有显著的影响（灵敏度、准确度等），则可以采用标准添加校准程序（参考ISO12787）。4试剂
在分析试验中，除非另有说明，仅使用分析纯试剂和蒸馏水或符合ISO3696：1987标准的1级水。溶剂应具有适合HPLC-MS的品质。4.1甲醇，HPLC-MS级。
4.2乙醇，HPLC-MS级。
-TTKAOIKAca
GB/T35956—2018/ISO15819:20144.3二氯甲烷，HPLC-MS级。
4.4N-亚硝基二乙醇胺，纯度高于95%。N-业硝基二乙醇胺标准物质信息参见附录NA中的表NA.1.
4.5氛代d8-N-亚硝基二乙醇胺，纯度高于95%。4.6醋酸铵，分析纯（适合HPIL.C-MS）。4.71mo1/L醋酸铵溶液，77.08g醋酸铵溶于1.0L水。4.8洗脱液A：2mmol醋酸铵水溶液，取2ml.1mol/L.醋酸铵溶液（4.7)，用水定容至1L。4.9洗脱液B:2mmol醋酸铵甲醇水溶液（甲醇与水体积比为9：1）,取2mL1mol/L醋酸铵溶液（4.7），用9：1（体积比）甲醇水溶液定容至1L。5仪器
使用标准实验室玻离仪器和设备，外加以下设备：5.1涡旋混合器
5.2样品处理站SPE位用中的样品处理站（如Vacmaster）。机（最佳为20000G）。
5.3高速离心
注：如果使用离
心速度低手2古的商心机·要注点在SPE净化过程中可能发生的堵塞问题
如有必要，可增
m孔径的膜过滤器的过滤步骤
5.4固相萃
取小柱，例如Bakerband
（平均直径
5.5高效液相色谱申联质谱设备
mL，500mg皮相十八烷基硅烷键合到硅胶上，40APD高效妆液相色谱仪，包拆洗脱液储存器进样系统数据处理
接到利用电喷雾离子化的电联质谱仪上
5.5.2分析用反相高效液相色谱分离机分离柱
球形粒子大小：
保护柱
长度：
内径：
球形粒子大小：
如Spherrsorb
21mm~3.0mm；
5um。
如带有绘图器的积分仪，连
ODSIL配有保护柱，柱尺寸如下：可以选择是否使用保护柱。如果使用，它的内径最好与分高柱的内径相同。宜根据分析反相高效液相色谱分离柱的品牌调整使用条件。6样品制备与储存
6.1综述
警告：大多数N-亚硝胺是强致癌物质，为避免人体接触，应采取所有可能的预防措施1）Bakerbond和Vacmaster是适合本实验的商业化产晶例子，给出该信息是为了方便使用本方法的用户，它并不表示ISO对本产品的担保。
2）Spherisorb是适合本实验的商业化产品例子，给出该信息是为了方便使用本方法的用户，它并不表示ISO对本产品的担保。
iKoNiKAca
GB/T35956-—2018/ISO15819:2014拿取N-亚硝胺或其溶液的所有操作宜在通风充分的通风厨或手套式操作箱内进行。常用的橡胶外科手套不能提供彻底的防护，因此不能长期穿戴，在使用后宜立即脱下并处置。安全处置任何含有N-亚硝胺的溶液（例如使用处置有害化学废料的罐头或提桶）。NDELA应在2℃～8C环境下避光保存。紫外线会使NDELA降解，因此溶液（包括标准溶液和提取液）在储存中应采取措施防止变质和组分改变。
样品萃取后，通常宜在30min内进行HPLC-MS-MS分析。如果分析延迟，建议验证其稳定性。6.2标准溶液制备
6.2.1精确配制大约含有1.0mg/mLNDELA的乙醇储备液A，避光、低于一18C保存。记录精确浓度。
6.2.2精确配制大约含有1.0mg/mLd8一NDELA的乙醇储备液d8A，避光、低于一18℃保存。记录精确浓度
6.2.3用连续稀释储备液A法，制备工作溶液（B、C、D、E、F）。所有溶液应在2℃～8C环境下避光保存。
工作溶液
工作溶液B
工作溶液C
工作溶液D
工作溶液E
工作溶液F
储备液或工作溶液体积
100μL储备液A
100uL工作溶液B
100μL工作溶液C
100工作溶液D
100μL工作溶液E
水体积
900μL
900μL
900μL
900μL
900μL
注：只要最终浓度是可靠的，则使用者可以确定用于制备的实际体积、最终浓度
100.0μg/ml
10.0μg/mL
1.0μg/mL
100.0ng/ml
10.0ng/mL
稳定期
6.2.4用连续稀释储备液（d8A）法，制备d8工作溶液（d8B和d8C），所有溶液应在2℃～8℃环境下避光保存。
工作溶液
工作溶液d8B
工作溶液d8C
储备液或工作溶液体积
20储备液d8A
200μL工作溶液d8B
水体积
1800μL
注：只要最终浓度是可靠的，则使用者可以确定用于制备的实际体积。最终浓度
1.0μg/ml
100.0ng/mL
稳定期
6.2.5稀释工作溶液以制备标准溶液。利用下表7个标准溶液中至少5个标准溶液，制成1.0ng/mL～80.0ng/mL的标准曲线。对应于所要求的定量限（或下限）的标准溶液宜被包括在内。每个溶液中所有溶液应在2℃～8℃环境下避光保存。内标物d8-NDELA的浓度为20ng/mL。标准溶液
标准溶液1
标准溶液2
标准溶液3
工作溶液体积
工作溶液E
工作溶液E
200μL
工作溶液E
工作溶液
d8c体积
200μL
200μL
200μL
400μL
最终浓度
80.0ng/mL
40.0ng/mL
20.0ng/mL
d8-NDELA
20.0ng/mL
20.0ng/ml
20.0ng/ml
稳定期
-irKAoNiKAca
GB/T35956—2018/ISO15819:2014标准溶液
标准溶液4
标准溶液5
标准溶液6
标准溶液7
工作溶液体积
100μL
工作溶液E
工作溶液F
250μL
工作溶液F
100 μL
工作溶液子
工作溶液
d8C体积
200μL
（续）
700μL
300μL
550μL
700μL
最终浓度
10.0ng/mL
d8-NDELA
20.0ng/mL
20.0ng/ml
20.0ng/mL
注1：为了使可
能的基质效应最小化，标准曲线和样品制备可根据仪器灵敏度调整注2：只要最餐浓度是可靠的，则使用者可以确定用于制备的实际体积。6.3
样品制备
6.3.1SPE争化
精确称取丝
为1.0g样品（记录精功质量数
动15min此为样品提取液，如有必要，可尽量减少超声
超声和
的d8B
稳定期
作溶液，用水定容至20.0mL。摇高心10m为避免亚硝胺进
步产生，宜
注：为减少因基质组分共洗脱所造成的电离抑制问题，在主HPLCMS-MS灵域度充作的情况下可以采用较少的样品量和/或较大的初始水体和，改变水的体积时，应保持标准液和样品液内标物的浓度法执行正确的计算。
致，除非无
Cis固相举取小柱以大约3.0mL/mn流速依次用3.0ml甲醇3.0mL水活化。注意不要使柱子
千透。
收集之后大约2mL
取大约5mL样品提取液装入上述Ci固相萃取小柱中，弃去前3mL流出液。的流出液（流速约为3.0mL/min）于小瓶中。如果需要，平行制备三份样品。6.3.2
在水中不分散的样品的另一种样品制备方法（二氢甲净法化）精确称取约0.2g样品（记录精确质量数）于离心管中，加人800uL的d8C工作溶液，摇动1min。加人4mL二氯甲烷，摇动1min。加人3.2mL水，摇动5min。注：为减少因基质组分共洗脱所造成的电离抑制问题，在HPLC-MS-MS灵敏度允许的情况下，可以采用较少的样品量和/或较大的初始水体积。当改变水的体积时，应保持标准溶液和样品溶液中内标物的浓度一致，除非无法执行正确的计算。
以尽可能高的速度离心（理想的为20000G)5min。取上层部分水溶液用于色谱分析。如有必要，用合适的过滤器过滤收集液。如果需要，平行制备三份样品。6.3.3进一步稀释样品液和标准溶液（可选）为尽可能减少基质组分共洗脱所产生的潜在影响（这种影响会抑制NDELA离子化，限制方法的灵敏度），建议对样品提取液和相应的标准溶液进行另外的稀释。用水稀释样品提取液和标准水溶液至灵4
iKAoNiKAca
敏度能适合所应用的特定HPLC-MS-MS系统。6.3.4样品储存
如有必要，样品可低于8℃环境下避光储存。检测步骤
GB/T35956—2018/ISO15819:2014上述两种样品制备方法，最终提取液都是用HIPLCMS-MS分析NDELA。7.2
色谱条件
流动相：洗脱液A
洗脱液
梯度：
时间间隔/m
流速：0.4ml/min。
进样量：20ul
柱温：30
2mmgl醋酸铵水溶液（4.8）
2mmol醋酸铵（体积比=90：10）甲醇水溶液（49）洗脱液A/%
8℃避光推
样品储存：
洗脱液皮%
样品运行：每次运行包括至少5个标准曲线点，每15个样品提取液至少有一个对照样（一个标准溶液）（如果样品量少于15个，至少要带一个对照样）。允许运行至少20个样品提取液，如果证明有足够的托盘稳定性，可以有更大的运行数目。对于某些被确证的基质，液相色谱条件可能需要调整。（见IS012787）HPLC-MS-MS条件
电喷雾，正离子模式。
以三重四极杆质谱仪为例（如ABSciex55003)）给出适当的参数：源设置
离子喷雾电压（ISV)）
去簇电压（DP）
源温度（TEM）
雾化器气（GS1）
涡轮气（GS2）此内容来自标准下载网
650℃
70units（氮气）
70units（氮气）
3）ABSciex5500是适合本实验的商业化产品例子，参数设置取决于所用液相色谱串联质谱系统。给出该信息是为了方便使用本方法的用户，它并不表示ISO对本产品的担保。5
TiKANKAca
GB/T35956—2018/ISO15819:2014气帘气（CUR）
分析器设置
扫描模式
Q1分辨率
Q3分辨率
碰撞活化解离气体（CAD）
30units（氮气）
多反应监测（MRM)对（NDELA用两个选择反应监测，对内标物用一个选择反应监测）
12unit（氨气）
特征离子135（M+H），104和74（碎片离子）鉴定样品中存在NDELA。通过NDELA的两个主要碎片离子104（来自NDELA）和111[来自d8-NDELA的143（M+H)的离子峰强度比率来定量NDELA。
8结果计算
8.1R值的测定
对每次进样（包括校准曲线点，样品提取液和对照样），测定R值，R值被定义为NDELA（M+H）离了的碎片离子104和d8-NDELA（M+H）离子的碎片离子111的离子峰强度比率。（见例，图A.2）。这些R值被用来确定校准曲线和浓度c（如8.4中所示）。8.2校准曲线
以标准溶液中NDELA的浓度对R值作图，得到校准曲线。用于定量测定的校准曲线，其相关系数应大于或等于0.990（见例图A，1）。8.3有效性检查程序及其标准
在相同实验条件下测定校准标准溶液和样品溶液，样品溶液两个监测离子（104和74)的相对强度（以最强离子强度百分比计），应与校准标准溶液的这两个监测离子的相对强度相符，二者容差应符合表1。
通过测试已加人检测限以上浓度的NDELA样品，核对检测方法的有效性。表1相对离子强度的最大允许偏差相对离子强度
（相对于基础离子强度的百分数）>50%
>20%～50%
>10%~20%
≤10%
8.4浓度计算
允许的相对偏差
利用R值测定被提取样品的浓度c（ng/mL），直接从校准曲线上读出浓度。用式（1）计算未知样品的NDELA浓度：W=cXV/m
TiKAONrKAca
式中：
GB/T35956—2018/IS015819:2014每克化妆品样品中NDELA质量分数，单位为纳克每克（ng/g）；提取液中NDELA浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；化妆品样品称取质量，单位为克（g）)；化妆品稀释体积，单位为毫升（mL）（例如，用于SPE净化是20mL，用于二氯甲烷净化是4mL).
注：倘若利用不同体积，那么V值可以调整（见6.3.1和6.3.2中的注）。9
检测报告
检测报告应至少包括以下信息：a)
识别样品的所有必要信息：
识别进行测试的实验室的所有必要信息；本标准的参考文献，
取样形式和日期（如果知道）；实验室收到样品的日期
测试期
g）结果和结果的表达中位
采用的净化方法；
任何检测过程中发现的特殊
可能影响结果的本力法中
指明的任何操作或选用的操作；k）报告负责人的身份及金
TKAoNIKAca
GB/T35956—2018/ISO15819:201414
说明：
（资料性附录）
校准曲线和色谱图示例
标准溶液中NDELA浓度（ng/mL）；R值。
NDELA校准曲线的示例
SRM=m/=1351041.51
面积：26191cps
0.60.8101.2
1.41.61.82.02.22.4
时间/min
GB/T35956—2018/ISO15819:2014SRM=m= 135+74
面积：20815cps
0.60.81.01.2
141.61.82.02.22.4
时间/min
SRM-m=143-111 1.47
面积：164273cps
0.60.81.01.2
1.41.61.82.02.22.4
时间/min
HPLC-MS-MS色谱示例
由分析1.0ng/mL校准溶液获得，该浓度对应于基质中含有NDELA20ng/g。数据获得方法：采用ABSciex5500三重四极杆质谱仪分析，对样品的水提取物再用水稀释4倍。NDELA（定量选择离子反应监测SRM)，上右图：NDELA（第二个选择离子反应监测SRM)；下图：d8-NDELA（内标液选择离子反应监测SRM)。
GB/T35956—2018/IS015819.2014附录NA
（资料性附录）
N-亚硝基二乙醇胺标准物质信息表NA.1N-亚硝基二乙醇胺中文名称、英文名称、英文缩写、CAS号、分子式、相对分子质量及结构式序号
中文名称
N-亚硝基
二乙醇胺
英文名称
N-nitrosodiethanolamine
英文缩写
CAS号
1116-54-7
分子式
相对分
子质量
结构式
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