本文件规定了采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）测定纺织品中动物毛纤维混合物组分的定性定量方法。 非动物毛纤维组分可参照GB/T 2910（所有部分）进行检测，再将所得结果结合起来确定整体纤维含量。 本方法参照FZ/T 01057.3，采用光学显微镜观察混合纤维的外观形态进行初步鉴定。本方法不适用于同物种的动物纤维同时存在的情况（例如山羊绒和马海毛的混合物），此类样品可通过镜检法分析定量（例如GB/T 40905.1和GB/T 40905.2所述的分析方法）。

ICS59.080.01
CCSW 04
中华人民共和国国家标准
GB/T42699.2—2023
纺织品
某些动物毛纤维蛋白质组定性
和定量分析第2部分：还原蛋白质多肽　分析基质辅助激光解吸电离
飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）法　Textiles-Qualitative and quantitative proteomic analysis of someanimal hair fibres-Part 2 :Peptide detection using MALDI-TOF-MS(ISO 20418-2:2018, MOD)
2023-08-06发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2024-03-01实施
GB/T42699.2—2023
规范性引用文件
术语和定义
缩略语
仪器和器具
试验步骤
精密度
实验室间试验
试验报告
附录A（资料性）
附录B（资料性）
附录C（资料性）
提取蛋白的SDS-PAGE凝胶图像示例MALDI-TOF-MS分析的动物物种特异性质谱峰MALDI-TOF-MS分析中的物种特异单同位素峰附录D（资料性）山羊绒-绵羊毛混合物的标准曲线附录E（资料性）
附录F（资料性）
山羊绒-耗牛绒混合物的标准曲线重复性和再现性
附录G（资料性）MALDI-TOF-MS盲样检测分析附录H（资料性）
参考文献
实验室间验证·
GB/T42699.2—2023
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
品某些动物毛纤维蛋白质组定性和定量分析》的第2部分。本文件是GB/T42699《纺织品
GB/T42699已经发布了以下部分
一第1部分：还原蛋白质多肽分析液相色谱-质谱（LC-ESI-MS)法：一第2部分：还原蛋白质多肽分析基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS)法本文件修改采用ISO20418-2：2018《纺织品某些动物毛纤维蛋白质组定性和定量分析第2部分：还原蛋白质多肽分析基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS)法》。本文件与ISO20418-2：2018的技术差异及其原因如下：一增加了警示；
一第1章中，用我国文件GB/T2910（所有部分）代替了ISO1833（所有部分），FZ/T01057.3代替了ISO/TR11827，GB/T40905（所有部分）代替了ISO17551（所有部分），以适应我国的技术条件；
第6章中，对试剂的规定做了符合我国实际情况的规定；—一6.1中，用我国文件GB/T6682代替了ISO3696，以适用我国的技术条件；-6.4中，磷酸二氢钠的质量修正为24g；一6.14中，增加了物质的CAS号；—第7章中，增加了7.9“离心管”、7.10“96孔微板”、7.11“pH计”及7.12“离心机”；—8.3.4中，增加了回收条带大小，更具有可操作性；8.5.1中，将反射模式更改为反射模式或线性模式。本文件做了下列编辑性改动：
3.1中，调整了动物毛纤维的定义，与ISO20418-1：2018中的定义保持一致。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国纺织工业联合会提出。本文件由全国纺织品标准化技术委员会（SAC/TC209）归口。本文件起草单位：上海海关工业品与原材料检测技术中心、中纺标检验认证股份有限公司、安徽正霖纺织有限公司、昊江美锦织造有限公司、浙江依蕾毛纺织有限公司、长兴金发纺织股份有限公司、普江市广知林针织有限公司、上海爱丽纺织技术检验有限公司、东莞市惟思德科技发展有限公司、湖南科力嘉纺织股份有限公司、义乌日清家居用品有限公司。本文件主要起草人：费静、陈晓、费娅、魏孟媛、斯颖、高麟美、姚玲、王亚、张春华、沈祎蕾、金飞、章文福、徐汕文、张直焕。
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对于纺织品中某些动物毛纤维蛋白质组定性和定量分析试验方法，为方便使用，按照不同的试验原理和方法分为多个部分，GB/T42699《纺织品某些动物毛纤维蛋白质组定性和定量分析》拟由以下两个部分组成。
一第1部分：还原蛋白质多肽分析液相色谱-质谱（LC-ESI-MS）法。目的在于确立采用液相色谱-质谱法（LC-ESI-MS)测定纺织品中动物毛纤维混合物组分的定性定量方法。第2部分：还原蛋白质多肽分析基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS)法。目的在于确立采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS)测定纺织品中动物毛纤维混合物组分的定性定量方法纺织品某些动物毛纤维蛋自质组定性GB/T42699.2—2023
和定量分析第2部分：还原蛋自质多肽分析基质辅助激光解吸电离
飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）法警示一一使用本文件的人员应有正规实验室工作的实践经验。本文件并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1范围
本文件规定了采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS)测定纺织品中动物毛纤维混合物组分的定性定量方法。非动物毛纤维组分可参照GB/T2910（所有部分）进行检测，再将所得结果结合起来确定整体纤维含量。
本方法参照FZ/T01057.3，采用光学显微镜观察混合纤维的外观形态进行初步鉴定。本方法不适用于同物种的动物纤维同时存在的情况（例如山羊绒和马海毛的混合物），此类样品可通过镜检法分析定量（例如GB/T40905.1和GB/T40905.2所述的分析方法）。2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
2分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682一2008.ISO3696：1987.MOD）GB/T6682
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
动物毛纤维animalhairfibre
自动物毛囊生长具有多细胞结构、由角蛋白组成的纤维。示例：山羊绒、绵羊毛、耗牛绒等。3.2
蛋白质protein
在生物内发挥重要作用的氨基酸聚合体。3.3
多肽peptide
由少于50个氨基酸脱水缩合而成的小片段蛋白质（3.2）。3.4
缓冲液buffer solution
保持反应溶液pH在合适范围内的溶液。GB/T42699.2—2023
峰标记
marker
用于定性定量鉴别的动物物种特异性单同位素峰的m/之。注：m/的解释见第4章。
缩略语
下列缩略语适用于本文件，
SDS-PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳法（sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis），一种根据蛋白相对分子质量大小进行蛋白质分离的方法。MALDI：基质辅助激光解吸电离法（matrix-assistedlaserdesorption/ionization），一种质谱软电离法。
TOFMS：飞行时间质谱分析法（timeofflightmassspectrometry），一种由于相对分子质量不同导致离子在相同通道内的飞行时间不同的质谱分析方法。m/：带电粒子的质量数与电荷数之比（mass-to-chargeratio），无量纲量。5原理
使用十二烷基磺酸钠（SDS)/二硫苏糖醇（DTT)/磷酸盐缓冲液，提取动物毛发中的蛋白质。提取的蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)纯化，再经胰蛋白酶对凝胶中的蛋白质进行酶解。使用MALDI-TOF-MS对物种特异的蛋白质比例进行分析。对照标准曲线计算出混合物中各动物毛纤维的含量。
6试剂
除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂。部分试剂可从市场上采购。6.1水，GB/T6682规定的三级水。6.2磷酸二氢钠，纯度≥99%。
磷酸氢二钠，纯度≥99%。
6.4磷酸二氢钠溶液（0.2mol/L）：磷酸二氢钠24g
加水溶解至1L。
6.5磷酸氢二钠溶液（0.2mol/L）：磷酸氢二钠28.4g
加水溶解至1L。
6.6磷酸缓冲液（pH=7.8,0.2mol/L)：-0.2mol/L磷酸二氢钠溶液（6.4）-0.2mol/L磷酸氢二钠溶液（6.5）100mL
将0.2mol/L磷酸二氢钠溶液（6.4)加人0.2mol/L磷酸氢二钠溶液（6.5）中，调整溶液pH为7.86.7十二烷基磺酸钠（SDS），纯度≥99.5%。6.8二硫苏糖醇(DTT)，纯度≥97%。SDS缓冲液：www.bzxz.net
-0.2mol/L磷酸缓冲液（pH=7.8）（6.6）2
加水至100mL。
）提取缓冲液：
SDS缓冲液（6.9）
将DTT溶于0.25mL的SDS缓冲液中，现配现用。6.11碘乙酰胺（IAA)溶液：
碘乙酰胺（≥98%）
溶于50μL的水，现配现用。
DTT溶液：
溶于10μL水，现配现用。
小尺寸聚丙烯酰胺凝胶
三羟甲基氨基甲烷（Tris），CAS号：77-86-1，纯度≥99.9%。3-（N-吗啉基）丙磺酸（MOPS），纯度≥99.5%。Tris-MOPS缓冲液：
加水至1L。
6.17Tris缓冲液（o.5mol/L）：Tris
加人1mol/L的盐酸，将溶液的pH调整至6.8。加水至100mL。
3上样缓冲液（样品缓冲液）：
-0.5mol/L的Tris缓冲液（pH=6.8）一10%的SDS
甘油，纯度≥99%
加水至10mL。
9考马斯亮蓝（CBB)染色液。
6.20碳酸氢铵，纯度≥96%。
碳酸氢铵溶液（100mmol/L）：
碳酸氢铵（6.20）
加水至1L。
2乙腈，纯度≥99.8%。
3洗涤液：
100mmol/L的碳酸氢铵溶液（6.21）乙腈
GB/T42699.2—2023
15-环已基-1-戊基-3-D-麦芽糖苷（CYMAL-5），一种能稳定胰蛋白酶，并能降低微孔板表面对胰蛋3
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白酶消化多肽进行吸收的去垢剂，6.25测序级的胰蛋白酶1）（trypsin）。6.26消化液：
一100mmol/L的碳酸氢铵溶液（6.21）CYMAL-5
加水至100mL。
6.27胰蛋白酶溶液：
测序级的胰蛋白酶（6.25）
-0.01mol/L的盐酸
消化液（6.26）
20 μg
300μL
将消化液置于冰上，加入100uL溶有测序级的胰蛋白酶的0.01mo1/L的盐酸，使用前配制。三氟乙酸（TFA），纯度≥99.8%。6.28
α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA），纯度≥99.5%（HPLC级），用作MALDIMS质谱分析里多肽的6.29
基质。
基质溶液：
乙晴/0.1%TFA(7：3)
7仪器和器具
7.1球磨仪：用于将织物或纤维制成极细（粒径<0.2mm)的粉末。7.2金属浴：能保持恒定的温度，30℃～100℃。7.3旋涡振荡器：用于均匀混合液体。7.4小型蛋白电泳装置。
割胶器或刀片2）：将含有目标蛋白的凝胶切割出来。200μL的带吸头的移液器，将吸头尖切去2cm可以作为凝胶圆点割胶器
7.6微量移液器：0μL～20μL（±0.20μL）、20μL～200μL（±1.60μL）、200μ～1000μ（±8μL）。7.7
吸头，吸头尖端带有层析介质，用于浓缩和纯化样品。7.81
MALDI-TOF质谱仪，用于多肽相对分子质量的检测。离心管：1.5mL，可承受6500g及以上转速。7.9
96孔微板：由情性材料制成，适用于微量应用，如储存、样品或试剂转移等有96个小孔的平板。pH计：精度为0.01。
离心机：转速为6500g及以上。
8试验步骤
8.1样品准备
8.1.1将有代表性的足量样品用剪刀剪碎，取（12.5士2.5）mg的试样置于含有0.25mLSDS缓冲液(6.9）和6颗研磨球的1.5mL离心管（7.9）中。8.1.2纤维试样在25Hz功率下的球磨仪（7.1）中研磨30min。1）测序级胰蛋白酶是成熟的商业化产品。给出此信息是为了方便使用者而非出于商业目的。2）直径约1.8mm的割胶器是成熟的商业化产品。给出此信息是为了方便使用者而非出于商业目的4
8.2蛋白提取
GB/T42699.2—2023
8.2.1使用微量移液器（7.6）向离心管（7.9）中加人0.25mL的提取液（6.10），使用旋涡振荡器（7.3）混匀。
8.2.2将装有试样的离心管置于95℃的金属浴（7.2)中反应15min。8.2.3在室温下，以6500g的转速离心1min。加人10uLDTT溶液（6.12）后，重新置于95℃的金属浴中反应15min。
8.2.4在室温下，加人50μLIAA溶液（6.11)反应15min，使蛋白烷基化以阻止二硫键的形成8.2.5加人20μLDTT溶液（6.12)终止反应。8.2.6在室温下，以6500g的转速离心5min，将上清液转移至另一个反应管，即为蛋白提取液，待用。8.3使用SDS-PAGE对提取的蛋白进行部分纯化8.3.1使用小尺寸聚丙烯酰胺凝胶（6.13）和小型蛋白电泳装置（7.4）对蛋白提取液（8.2.6）进行SDSPAGE电泳纯化，以去除相对分子质量过大或过小的蛋白。8.3.2使用上样缓冲液（6.18)将蛋白提取液（8.2.6）稀释3倍，取稀释后的样液5μL～10μL加人小尺寸聚丙烯酰胺凝胶（6.13)梳孔中。8.3.3电泳15min后，取出凝胶。使用考马斯亮蓝（6.19）染色。8.3.4蛋白条带集中在上部、中部、下部三个区域（见图A.1），使用割胶器或力片（7.5）切割回收中间的直径约1mm条带（45000道尔顿左右）（见附录A示例）。8.3.5将凝胶置于96孔微孔板（7.10），用100μL洗涤液（6.23）洗涤10min后，再重复洗涤2次，每次1min，以除去考马斯亮蓝。加入100μL乙睛（6.22)洗涤凝胶，1min后吸出乙腈，将凝胶晾干（10士5)min。8.4胰蛋白酶消化蛋白
8.4.1待凝胶干了以后，加人35uL的胰蛋白酶溶液（6.27），在50℃水浴孵育1h。8.4.2使用带层析介质的移液吸头（7.7）纯化酶解物，并用1.5μL的基质（6.30）洗脱，移取至MALDI-TOF-MS的靶板上。
8.5MALDI-TOF-MS分析多肽
8.5.1使用MALDI-TOF-MS（7.8）的反射模式或线性模式分析多肽。设置激光能量至阈值水平以产生信号，加速电压20kV。
8.5.2质谱扫描频率至少50Hz，在靶板上的每个点样处分别测定三个不同位置的值，取此三个测定结果的平均值以保证试验的重复性。8.5.3动物物种特征峰出现在2450m/z～2750m/处。不同物种的特征峰示例在附录B和附录C中。在定量分析动物毛发纤维前，需先根据特征峰确定试样中动物毛纤维的种属。8.6计算含量
8.6.1根据山羊绒的峰高（hg）、绵羊毛的峰高（hw）、耗牛绒的峰高（h），利用公式（1）、公式（2）和公式（3)分别计算峰比值：
hg×100
G,=ha+hw+hy
hw×100
W,=ha+hw+hy
h,×100
Y,=ha+hw+hy
·（1）
GB/T42699.2—2023
式中：
G，——山羊绒的峰高比值，%；W，—-绵羊毛的峰高比值，%；
Y，--耗牛绒的峰高比值，%。
山羊绒、绵羊毛、耗牛绒的含量（%）根据8.7中的标准曲线来计算。8.6.2同样的方法也用于其他动物毛纤维，例如安哥拉兔毛和羊驼毛。通常，使用纤维1的峰高（h1）和纤维2的峰高（h2），利用公式（4）和公式（5）来计算纤维1和纤维2峰高的比值。h×100
式中：
F1p——纤维1的峰高比值，%;
F2p——-—纤维2的峰高比值，%。8.7标准曲线
h2×100
·（4）
·（5）
8.7.1将标准山羊纤维（山羊绒或马海毛）和绵羊毛，或者将山羊纤维（山羊绒或马海毛）与耗牛绒，分别以1：9、3：7、5：5、7：3和9：1的比例混合。使用球磨仪（7.1)将标样制成粉末。8.7.2按照8.2～8.6所述的对标准样品进行溶解分析，每个样品至少重复试验一次。8.7.3横纵坐标分别用混合物中的山羊绒峰比值和山羊绒含量（见附录D和附录E），对这些点进行曲线拟合。
8.8二组分混合物中每种纤维含量的计算使用峰比值（%）（8.6.1～8.6.2)以及标准曲线（8.7.3），计算山羊绒，绵羊毛和耗牛绒的含量。8.9三组分混合物中每种纤维含量的计算当试样中含有三种纤维，例如山羊绒，绵羊毛和耗牛绒：同时使用山羊绒-绵羊毛和山羊绒-耗牛绒定量标准曲线，计算山羊绒、绵羊毛和耗牛绒含量。总之，使用纤维1和纤维2的含量比值计算R12：使用纤维1和纤维3的含量比值计算R13，根据8.8所述，通过公式（6)和公式（7)得到纤维1和纤维3。C12F2
Ris=CiaF,
式中：
二组分混合物纤维1和纤维2中纤维2的含量，%；二组分混合物纤维1和纤维2中纤维1的含量，%：二组分混合物纤维1和纤维3中纤维3的含量，%；二组分混合物纤维1和纤维3中纤维1的含量，%。三种成分可使用公式（8）、公式（9）和公式（10）进行计算：100
CF, =1+R12+R13
R12×100
1+R12+R13
·（6)
.*( 7)
（8）
·（9）
式中：
CF——纤维1的含量，%；
CF—纤维2的含量，%；
纤维3的含量，%。
9精密度
R13×100
1+R12+R13
GB/T42699.2—2023
.（10）
本方法应用于实际样品的检测。重复性和再现性见附录F。在2013年至2015年期间，对已知成分样品的检测结果见附录G。
实验室间试验
在2016年12月至2017年2月，四家实验室参加了联合试验。共有10个用于构建山羊绒-绵羊毛以及山羊绒-耗牛绒的标准曲线的标准样品，检测了6个未知样品，结果见附录H。11
试验报告
试验报告应至少包括以下内容：本文件的编号；
样品描述；
试验结果，包括质谱的详细信息；任何偏离本文件的细节，
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