本文件提供了纳米材料遗传毒性作用机制、样品制备和表征以及体外和体内试验方法选择策略。本文件适用于纳米材料、含纳米材料的药物（纳米药物)及医疗器械产品的潜在遗传毒性评价。

ICS 11.120
CCS C 00
中华人民共和国国家标准化指导性技术文件GB/Z42246—2022
纳米技术
纳米材料遗传毒性
试验方法指南
NanotechnologiesGuideline on genotoxicity test methodsfor nanomaterials
2022-12-30 发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2023-07-01实施
规范性引用文件
术语和定义
缩略语
纳米材料遗传毒性试验方法的选择5.1
纳米材料遗传毒性作用机制
5.2样品制备和表征
5.3试验方法选择策略
附录A（资料性）纳米材料体外遗传毒性试验的适用性附录B（资料性）纳米材料体内遗传毒性试验的适用性附录C（规范性）
纳米材料遗传毒性试验优化组合参考文献
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本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则起草。
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第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国科学院提出。
本文件由全国纳米技术标准化技术委员会（SAC/TC279)归口。本文件起草单位：中国食品药品检定研究院、国家纳米科学中心本文件主要起草人：文海若、陈亮、邵安良、徐丽明、吴晓春。m
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随着纳米技术的飞速发展和大量纳米材料的涌现，人体与纳米材料接触的机会日益增加，纳米材料的安全性评价成为科学界和各国监管部门高度关注的热点。遗传毒性试验是非临床安全性评价的重要内容，通过一系列试验评估试验样品是否有遗传毒性，对试验样品的致癌性进行预测，从而降低其对人群的危害风险[5]。纳米材料有可能进人细胞，与细胞遗传物质（DNA或染色体)产生直接或间接的相互作用，通过氧化应激或炎症等作用机制诱发DNA或染色体损伤[201-[24-26]。目前，纳米材料的遗传毒性研究已发展为一个专门的亚分支研究领域“纳米遗传毒理学”。美国食品药品监督管理局（FDA)及经济合作与发展组织（OECD)等国家与国际监管机构已经认识到当前的标准遗传毒性组合试验应用于纳米材料的遗传毒性风险评价时存在的局限性[17]。OECD纳米材料产品工作组（WPMN）于2014年在纳米材料产品安全性系列文件第43号《纳米材料产品遗传毒性：OECD专家专题研讨会报告》（以下简称“43号文件”)[15]中就纳米材料遗传毒性评价中的共性问题达成7项共识。本文件基于纳米材料遗传毒性试验研究成果并参考国际相关遗传毒性指导原则及OECD的43号文件等起草，是经全国纳米技术和遗传毒理研究领域专家、纳米材料及相关产品的研发机构代表讨论后达成的共识。
本文件为含纳米材料药物及医疗器械的研发、安全性评价及监管提供参考。IV
1范围
纳米技术纳米材料遗传毒性
试验方法指南
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本文件提供了纳米材料遗传毒性作用机制、样品制备和表征以及体外和体内试验方法选择策略。本文件适用于纳米材料、含纳米材料的药物（纳米药物）及医疗器械产品的潜在遗传毒性评价2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T16886.3一2019医疗器械生物学评价第3部分：遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验GB/T16886.12一2017医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照材料GB/T30544.4一2019纳米科技术语第4部分：纳米结构材料GB/T32269一2015纳米科技纳米物体的术语和定义纳米颗粒、纳米纤维和纳米片GB/T39261纳米技术纳米材料毒理学评价前理化性质表征指南GB/T41316—2022分散体系稳定性表征指导原则3术语和定义
GB/T16886.3—2019、GB/T16886.12—2017、GB/T30544.4—2019、GB/T32269—2015和GB/T41316一2022界定的以及下列术语和定义适用于本文件3.1
遗传毒性试验
genotoxicity test
采用哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞、细菌、酵母菌、真菌或整体动物测定试验样品是否会引起基因突变、染色体结构畸变以及其他DNA或基因变化的试验。［来源：GB/T16886.3—2019,3.3］3.2
纳米材料nanomaterial
任一外部维度、内部或表面结构处于纳米尺度的材料。注：本通用术语包括纳米物体和纳米结构材料。［来源：GB/T30544.4—2019,2.3］3.3
沉降sedimentation
由于分散相密度高于连续相密度产生的分散相的向下移动沉淀（分离）的现象。注：如果液态分散相(乳浊液)的密度大于连续相的密度，液滴会沉降，如油包水乳剂。［来源：GB/T41316—2022，3.13，有修改1
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试验样品testsample
用于生物学或化学试验或评价的医疗器械、组件或材料（或用相同方法生产和加工的具有代表性的样品），或其浸提液。
L来源：GB/T16886.12一2017，3.16，有修改4缩略语
下列缩略语适用于本文件：
替代、减少和优化（replacement，reduction，refinement）CHO细胞：中国仓鼠卵巢细胞（Chinesehamsterovarycell）CHL细胞：中国仓鼠肺细胞（Chinesehamsterlungcell）CytoB:
MLA：
细胞松弛素B（CytochalasinsB）脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）小鼠淋巴瘤试验（mouselymphomaassay）模拟体液（simulatedbodyfluid）5纳米材料遗传毒性试验方法的选择5.1纳米材料遗传毒性作用机制
纳米材料遗传毒性可能的作用机制主要包括两方面[22]：一是未进人细胞核，通过诱导大量活性氧或炎症因子的生成间接导致遗传物质损伤；二是通过扩散、穿越核孔复合体和在细胞有丝分裂或减数分裂过程中被核膜包裹三种途径进入细胞核，直接作用于DNA导致遗传物质损伤5.2样品制备和表征
5.2.1通则
不同来源的纳米材料的理化性质和稳定性往往差异较大。体相材料尺寸减小到纳米尺度后，其在生物体内的分布、蓄积及代谢动力学等特征可能会发生显著改变。纳米材料的毒性与其粒径、表面修饰和表面电荷等理化性质密切相关[26].[3]。纳米材料在理化性质上的微小差别可能直接导致其安全性和毒性靶器官的不同。因此安全性评价需要强调对纳米材料的理化性质进行充分表征。拟评价的医用纳米材料的生产工艺及产品质量宜与临床试验用样品或上市后样品基本一致。对不同产品进行评价时遵循“具体案例具体分析”的原则。5.2.2试验样品制备方法
5.2.2.1试验样品制备的总体原则是最大程度模拟试验样品与人体实际接触的方式。分散介质可能影响纳米材料的尺寸，从而影响试验样品的沉降、团聚、细胞暴露、细胞毒性、剂量选择和遗传毒性试验结果。单纯的纳米材料试验样品，需充分考虑其在分散介质中的分散性，选择合适的介质，确保分散均匀：减少团聚14]。
5.2.2.2含纳米材料的医疗器械（含纳米材料的基质类固体产品）按照GB/T16886.3一2019和GB/T16886.12一2017，或根据含纳米材料产品预期临床使用的微环境和纳米材料的释放特征选择合适的浸提介质。具体如下：
a）在通常情况下，含纳米材料固体产品的表面积/质量和浸提液体积之比（以平方厘米每毫升，2
即cm2/mL，或毫克每毫升，即mg/mL表示）宜尽可能高；GB/Z42246—2022
宜对浸提液中的纳米材料进行必要的表征，如颗粒物尺寸、分散性、表面电荷等。必要时测定b）
浸提液中纳来材料的浓度，以便对结果进行量-效关系的分析：宜选择不易吸附纳米材料的浸提容器（如低吸附的聚四氟乙烯材质的容器）：c）
浸提温度、时间等其他内容按照GB/T16886.3一2019中样品准备的相关条款执行；e）
金属纳米材料可能会释放金属离子，需考虑所释放的金属离子可能与分散介质中的其他离子发生反应。如纳米银可能会释放带正电荷的银离子，在含氯化钠的浸提液或者SBF中，当银离子的浓度足够高时可与分散介质中的氯离子形成氯化银颗粒物。此时，宜采取相应措施避免颗粒物形成，并充分评价非纳米材料颗粒物对试验体系和结果的影响。5.2.2.3
由于有些纳米材料具有极强的吸附特性，特别是对蛋白成分的吸附，因此在样品制备时如采用含有机成分的生理介质，宜评价纳米材料对介质中有机成分的吸附，及其对试验体系和试验结果解释的影响。
5.2.3表征
5.2.3.1开展遗传毒性试验之前，按照GB/T39261并参考纳米材料产品安全性系列文件第63号《物理化学参数：与纳米材料监管相关的测量和方法》16]等纳米材料表征的相关标准检测纳米材料的理化性质（包括粒径、形状、长径比、粒径分布、团聚及沉降状态、结晶度、表面积、分散性、纯度及稳定性等）。相同组分的纳米材料，如果理化性质不同，其潜在的遗传毒性风险可能不同，宜单独进行评价。5.2.3.2试验样品为可溶性纳米材料时，参考国际人用药品注册技术协调会《人用药物遗传毒性试验和结果分析指导原则》ICHS2（R1)5I进行常规的遗传毒性评价。因制备受试液的介质，特别是生物介质及温度等试验条件可能对纳米材料的理化性质及稳定性产生影响，宜对试验体系中的可溶性纳米材料进行全面的表征。
5.2.3.3为保证纳米材料在体外试验系统中的生物和物理环境状态与体内应用时的微环境状态有可比性，宜使用现有的方法对给药处理前和给药处理结束后的体内外评价系统中的纳米材料进行必要表征。5.3试验方法选择策略
5.3.1通则
纳米材料的遗传毒性试验目的是评价人体接触纳米材料的潜在遗传毒性风险。为全面考察试验样品的潜在遗传毒性风险，通常需开展一系列机制上互相补充的试验（即标准试验组合）来进行综合性评价，且标准试验组合的选择宜针对不同的遗传毒性终点5]。遗传毒性试验方法根据试验系统不同可分为体外和体内试验；主要的遗传毒性评价终点包括基因突变、DNA损伤和染色体损伤。考虑到动物实验替代、减少和优化的3R原则，当含纳米材料的试验样品需要进行遗传毒性评价时，优先开展体外遗传毒性试验。体内研究通常在体外研究基础上开展，并以靶器官相关毒性研究为前提。5.3.2体外遗传毒性试验方法的适用性5.3.2.1概述
不针对纳米材料，不同的体外遗传毒性试验评价方法的适用性分析见附录A，具体包括细菌试验体系和细胞试验体系。
5.3.2.2细菌试验体系
纳米材料不易与细菌的遗传物质充分接触，因此传统的细菌回复突变试验体系存在一些局限17]。此外，部分纳米材料（如纳米银及其释放的银离子等)具有一定的抑菌作用。因此，采用细菌回复突变试3
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验评价纳米材料的致突变风险可能得到假阴性结果。在采用细菌试验体系时，宜提供研究所用试验条件下细菌对该纳米材料的摄取、纳米材料的分散情况及是否具有抑菌作用的相关数据5.3.2.3细胞试验体系
宜使用可摄取纳米材料、遗传物质稳定的细胞系开展体外研究，如CHO细胞、CHL细胞等。此外，使用人抑癌基因（p53)功能完整的细胞系［如人淋巴母细胞（TK6)开展试验，可减少假阴性结果。细胞对纳米材料的摄取能力是解释试验结果的关键因素。在开展体外遗传毒性试验时，宜同时对细胞摄取能力进行分析（参考纳米材料产品安全性系列文件第36号《合成纳米材料安全性测试样品制备和剂量测定指南》14]），如哺乳动物细胞对某种纳米材料摄取能力有限，从直接遗传毒性的角度可认为该纳米材料对哺乳动物细胞的遗传毒性风险较低。对于体外染色体畸变试验和体外微核试验，宜根据细胞增殖和细胞毒性试验结果选择最高试验样品处理浓度。最高浓度所产生的细胞毒性宜控制在50%左右。通过相对群体倍增数（relativepopulation doubling，RPD）和/或相对细胞增长数（relative increase in cell count，RICC）来评估哺乳动物细胞的细胞毒性；对培养的人外周血淋巴细胞，可通过有丝分裂指数（mitotic index，MI)的降低来反映细胞毒性。某些情况下（如试验样品细胞毒性较大）可考虑增加浓度组并采用大于标准范围（/10倍）的浓度间隔，测试浓度范围宜包括无毒性或低毒性、中等毒性至约50%细胞毒性的浓度。必要时，可进行重复试验以保证获得较好的量效关系。因纳米材料进入细胞发挥作用的时间较久，体外染色体畸变试验和体外微核试验中试验样品处理时间宜包括短期处理组（3h～6h）和长期处理组（染色体畸变试验为1.5个细胞倍增时间，微核试验为2个细胞倍增时间），长期处理宜不低于24h，以保证纳米材料与遗传物质（直接或间接）充分地接触，胞质分裂阻断法微核试验中，添加CytoB可能干扰细胞骨架的形成，从而影响细胞对纳米材料的内吞作用。CytoB的给药方法可采用后处理（细胞与试验样品处理一段时间后，更换含CytoB的培养基)或延迟的共同处理（细胞与试验样品处理一段时间后，更换同时含试验样品与CytoB的培养基）的方法，从而保证纳米材料与细胞培养系统在无CytoB的情况下充分暴露。5.3.3体内遗传毒性试验方法的适用性5.3.3.1通则
针对纳米材料，不同体内遗传毒性试验的适用性分析见附录B，具体宜考虑取样组织和给药方式。5.3.3.2取样组织
开展体内遗传毒性研究前，需确定纳米材料在遗传毒性试验检测组织中的含量水平，必要时需开展毒代动力学和/或组织分布研究。如纳米材料在遗传毒性试验检测组织中含量较低，则相应试验方法可能不适用于直接遗传毒性的评价。5.3.3.3给药方式
体内研究中，当前没有足够的数据支持某种给药方式优于另一种给药方式。试验的给药方式需根据人最常见的暴露途径选择[28]。如果拟评价试验样品为医用纳米材料或者含纳米材料产品，给药方式宜根据材料/产品的实际使用方式确定。5.3.4遗传毒性试验优化组合
5.3.4.1通则
由于纳米材料特殊的纳米尺度效应和理化特性，使用传统遗传毒性试验方法评价纳米材料的遗传毒性时可能存在一定的局限性。纳米材料的遗传毒性评价宜尽量全面，以提供充分数据对纳米材料的4
致癌性进行预测，降低接触人群的危害风险。GB/Z42246—2022
本文件按照GB/T16886.3—2019并参考ICHS2（R1)[5]，在常规药物和医疗器械遗传毒性标准试验组合原则的基础上，给出了纳米药物和含纳米材料医疗器械的遗传毒性试验优化组合方案的考量。5.3.4.2细菌回复突变试验
细菌回复突变试验是首选的遗传毒性评价方法。虽然传统细菌回复突变试验不是研究纳来材料遗传毒性的推荐方法[17]，但作为对啮齿类动物肿瘤发生率预测效果最好的遗传毒性试验方法，不宜将其完全排除在现阶段纳米材料遗传毒性评价组合之外。宜在提供研究所用试验条件下细菌对该纳米材料摄取能力以及纳来材料分散性证据的基础上，考虑是否选择细菌回复突变试验，或者作为结果判定的参考。
5.3.4.3小鼠淋巴瘤tk基因突变试验小鼠淋巴瘤tk基因突变试验涵盖了基因突变和染色体断裂等检测终点，是推荐的第二项纳米材料潜在致突变能力检测方法L32]。在提供该研究相应数据的同时，宜提供研究所用试验条件下细胞对该纳米材料摄取能力以及纳米材料分散性的证据，作为试验结果判定的参考。5.3.4.4体外微核试验或染色体畸变试验检测致断裂剂的体外微核试验或染色体畸变试验在检测终点上与细菌回复突变试验和小鼠淋巴瘤tk基因突变试验互补，可任选一项作为第三项遗传毒性评价方法。在提供相应研究数据的同时，宜提供研究所用试验条件下细胞对该纳米材料摄取能力以及纳米材料分散性的证据，作为试验结果判定的参考。
5.3.4.5体内试验
可在啮齿类动物红细胞微核试验或哺乳动物骨髓染色体畸变试验或啮齿类动物体内彗星试验等中任选1项～2项作为体内试验。
5.3.4.6分阶段研究策略
遗传毒性试验优化组合中，5.3.4.2～5.3.4.5的4项试验内容可分阶段开展。纳米药物的遗传毒性评价宜包括3项体外研究（即细菌回复突变试验、小鼠淋巴瘤求基因突a
变试验和体外微核试验或染色体畸变试验）和1项～2项体内研究，并优先开展体外研究如4项试验结果均为阴性，认为其遗传毒性试验结果为阴性；如在充分考虑试验体系的适宜性的前提下，任一项体外研究结果为阳性，参考ICHS2(R1）L5进一步开展与检出阳性结果的评价终点一致的体内试验，并针对靶器官（组织)进行研究；
如体外遗传毒性试验结果为阳性，相应检测终点的体内遗传毒性试验结果为阴性，需参考证据权重原则，对其人体应用的风险进行评估；如体外试验结果均为阴性，而体内试验结果为阳性，认为试验样品存在遗传毒性风险，可进一步进行研究。
纳米药物遗传毒性试验组合试验应按照附录C的图C.1规定的步骤开展b）含纳米材料医疗器械的遗传毒性评价宜包括3项体外研究，试验项目选择同纳米药物。如3项试验结果均为阴性，认为其遗传毒性试验结果为阴性，无需进一步试验：如在充分考虑试验体系适宜性的前提下，任一项体外研究结果为阳性，可参考纳米药物的要求进一步开展体内试验进行验证，并需参考证据权重原则对其人体遗传毒性风险进行评估。含纳米材料医疗器械遗传毒性试验组合试验应按照附录C的图C.2规定的步骤开展。5
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