本文件提供了在进行分子分析之前的检验前阶段，用于RNA检验的福尔马林固定和石蜡包埋组织(FFPE)标本处理、记录、贮存及取材的指南。本文件适用于分子体外诊断检验，包括医学实验室和分子病理学实验室进行的实验室自建检测项目,也适用于实验室客户、体外诊断开发者和制造商、生物样本库、从事生物医学研究的机构和商业组织以及监管机构。?〓〓注： 国际、国家及区域法规要求同样适用于本文件涉及的特定内容。

ICS11.100.10
CCSC30
中华人民共和国国家标准
GB/T42216.1—2022/ISO20166-1:2018分子体外诊断检验
福尔马林固定及
石蜡包理组织检验前过程的规范第1部分：分离RNA
Molecular in vitro diagnostic examinations-Specifications for pre-examinationprocessesforformalin-fixed andparaffin-embedded(FFPE)tissue-Part 1:Isolated RNA
(IS020166-1:2018，IDT)
2022-12-30发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2023-07-01实施
规范性引用文件
术语和定义
实验室外部
5.1标本采集
5.2运送要求
实验室内部
关于标本接收的信息
标本/样品的福尔马林固定
标本的病理学评估和样品的选择冷冻样品的固定
处理及石蜡包埋
贮存要求
RNA的分离
分离RNA的数量和质量评估
RNA的贮存
GB/T42216.1—2022/IS020166-1:2018山
附录A（资料性）基于RT-qPCR对从福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE)组织样品分离的RNA进行质量控制
参考文献
GB/T42216.1—2022/ISO20166-1:2018本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件是GB/T42216《分子体外诊断检验第1部分。GB/T42216已经发布了以下部分：第1部分：分离RNA；
一第2部分：分离蛋白质；
—第3部分：分离DNA。
福尔马林固定及石蜡包埋组织检验前过程的规范》的本文件等同采用ISO20166-1：2018《分子体外诊断检验福尔马林固定及石蜡包埋组织检验前过程的规范第1部分：分离RNA》。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由国家药品监督管理局提出。本文件由全国医用临床检验实验室和体外诊断系统标准化技术委员会(SAC/TC136)归口。本文件起草单位：北京医院、中国合格评定国家认可中心、北京市医疗器械检验研究院（北京市医用生物防护装备检验研究中心）、北京大学人民医院、中日友好医院、复旦大学附属肿瘤医院、中国食品药品检定研究院。
本文件主要起草人：肖飞、赵晓涛、周亚莉、周晓燕、钟定荣、陈皇、毕春雷、李贺鑫、张文新。GB/T42216.1—2022/ISO20166-1:2018引
分子体外诊断(包括分子病理学)技术的出现使医学取得了重大进展。然而，分子体外诊断结果的准确性受诸多因素的影响，包括检验前过程的不规范操作。如在标本采集、运送、贮存及处理过程中的不规范操作可能造成这些分子的含量和/或完整性发生显著变化，后续的检验分析会受到检验前过程人为因素的影响，不能完全反映患者的真实状态，使得诊断或研究的结果受到影响。因此，需要对从标本采集到检测的整个检验前过程进行标准化。GB/T42216规定了福尔马林固定和石蜡包埋组织的分子体外诊断检验的检验前操作步骤的标准化要求，拟由4个部分组成。
第1部分：分离RNA。目的在于规范福尔马林固定及石蜡包埋组织的RNA检验的标准化检验前操作步骤，减少RNA谱的变化及修饰，保障后续检验结果的有效性及可靠性。第2部分：分离蛋白质。目的在于规范福尔马林固定及石蜡包埋组织的蛋白质检验的标准化检验前操作步骤，减少因蛋白质谱的变化及修饰对后续检验的影响。第3部分：分离DNA。目的在于规范福尔马林固定及石蜡包埋组织的DNA检验的标准化检验前操作步骤，减少因DNA谱的变化及修饰对后续检验的影响。第4部分：原位检测技术。目的在于规范化福尔马林固定及石蜡包埋组织原位检测的标准化检验前操作步骤，减少相关试验因素对原位检测结果的影响。1范围
GB/T42216.1—2022/ISO20166-1:2018分子体外诊断检验福尔马林固定及石蜡包埋组织检验前过程的规范第1部分：分离RNA
本文件提供了在进行分子分析之前的检验前阶段，用于RNA检验的福尔马林固定和石蜡包埋组织(FFPE)标本处理、记录、贮存及取材的指南。本文件适用于分子体外诊断检验，包括医学实验室和分子病理学实验室进行的实验室自建检测项目，也适用于实验室客户、体外诊断开发者和制造商、生物样本库、从事生物医学研究的机构和商业组织以及监管机构。
注：国际、国家及区域法规要求同样适用于本文件涉及的特定内容。2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T22576.1一2018医学实验室质量和能力的要求第1部分：通用要求（ISO15189：2012，IDT)
GB/T27020—2016合格评定各类检验机构的运作要求（ISO/IEC17020：2012，IDT）ISO15189医学实验室质量和能力的要求（Medicallaboratorics—Rcquirementsforqualityand competence)
ISO15190
医学实验室安全要求（Medicallaboratories一Requirementsforsafety）注：GB19781—2005医学实验室安全要求（ISO15190：2003，IDT）3术语和定义
ISO15189界定的以及下列术语和定义适用于本文件。ISO和IEC维护的用于标准化的术语数据库，地址如下：-ISO在线浏览平台：http：//www.iso.org/obp；-IEC电子百科：http：//www.electropedia.org/。3.1
等分样品aliquot
假定取样误差忽略不计时，大量均质物质的一部分。注1：该术语通常适用于液体。组织是异质的，所以不能等分。注2：该定义来源于参考文献[28]、[29]、[30]。3.2
Eambienttemperature
环境温度
未经调节的周围空气的温度。
GB/T42216.1—2022/ISO20166-1:20183.3
分析物analyte
被测量名称所代表的组分。
［来源：GB/T21415—2008，3.2，有修改，删除了示例3.4
分析测试性能analyticaltestperformance测试待测分析物(3.3)的检验的准确度、精密度和灵敏度。注：也适用于其他测试性能特性，如稳健性、重复性等。3.5
冷缺血coldischemia
组织自人体取出后至稳定或固定前的存在状况。3.6Www.bzxZ.net
互补脱氧核糖核酸
complementaryDNA;cDNA
互补DNA
在逆转录酶存在下合成的与给定的RNA互补的单链DNA，作为合成DNA拷贝的模板。［来源：GB/T39367.1---2020，3.12]3.7
诊断diagnosis
从其体征和/或症状中识别健康或疾病状态，诊断过程可以通过检验（3.10)和测试对个体状况进行分类，分成不同的类别或子类，以便做出关于治疗和预后的医学决策。3.8
脱氧核糖核酸deoxyribonucleicacid;DNA以双链或单链形式存在的脱氧核糖核苷酸聚合体。［来源：SN/T2102.1—2008,3.1.2］3.9
脱氧核糖核酸酶deoxyribonuclease;DNAase催化DNA(3.8)降解成更小组分的酶。3.10
检验examination
分析测试analyticaltest
以确定一个特性的值或特征为目的的一组操作。注：从提取的分析物开始并包括各种用于定性或定量检验的参数测试或化学操作的过程。[来源：GB/T22576.1一2018，3.7，有修改，删除了注1～注3，补充了新注，添加“分析测试”为首选术语
福尔马林formalin
质量分数为37%的饱和甲醛水溶液（相当于体积分数40%）。3.12
福尔马林固定formalinfixation用标准缓冲福尔马林溶液（3.25)处理样品使其稳定。3.13
大体检查grossing，grossexamination肉眼检查病理标本以获得诊断信息，同时进行组织处理用于进一步的显微检查。2
干扰物质interferingsubstancesGB/T42216.1—2022/ISO20166-1:2018能改变检验结果的标本（3.17)/样品（3.23)内源性物质或外源性物质（如固定剂）。石蜡包埋paraffinembedding
将组织样品置于石蜡中，产生固化的周围基质，从而能切割出薄层显微切片的过程。3.16
检验前过程
pre-examinationprocess
分析前阶段
preanalytical phase
分析前工作流程preanalyticalworkflow按时间顺序自医生申请至分析检验启动的过程，包括检验申请、患者准备和识别、原始样品采集、运送和医学或病理实验室内传递、分析物提取等。注：检验前阶段包括影响预期检验结果的准备流程。［来源：GB/T22576.1一2018，3.15，有修改，分析前工作流程被添加为首选术语，增加了注并扩展了定义」
原始样品primarysample
标本specimen
为检验、研究或分析一种或多种量或特性而取出的认为可代表全部的一独立部分的体液、呼出气、头发或组织等。
［来源：GB/T22576.1—2018，3.16，有修改，删除了注］3.18
能力验证proficiencytest
利用实验室间比对，按照预先制定的准则评价参加者的能力。［来源：GB/T27043—2012,3.7，有修改，删除了注］3.19
RNA谱RNAprofile
在没有任何损失、抑制或干扰的情况下，样品中存在并能测量的各种RNA分子的数量。3.20
核糖核酸
ribonucleicacid;RNA
以双链或单链形式存在的核糖核苷酸聚合体。［[来源：SN/T2102.1—2008,3.1.3］3.21
ribonuclease;RNase
核糖核酸酶
催化RNA降解成更小组分的酶。
室温roomtemperature
本文件中是指18℃25℃。
样品sample
取自原始样品的一部分或多部分。3
GB/T42216.1—2022/ISO20166-1:2018［来源：GB/T22576.1—2018，3.24，有修改，删除了示例］3.24
Estability
稳定性
在规定条件下贮存时，样品材料在规定时间内保持声称特性值在规定限值范围内的能力。注：本文件涉及的分析物是所分离的RNA。［来源：GB/T15000.2一2019，2.1.15，有修改，“标准样品”修改为“样品材料”，“特性”修改为“能力”，修改了注」
标准缓冲福尔马林溶液standardbufferedformalinsolution中性缓冲福尔马林neutralbufferedformalin;NBF10%福尔马林(3.8)水溶液，所含甲醛的质量分数为3.7%（相当于体积分数4%)，缓冲至pH=6.8～7.2。
注：标准缓冲福尔马林溶液通常含有少量甲醇以抑制甲醛的氧化和聚合。3.26
购存storage
在适宜的条件下长时间中断样品、分析物或其衍生物（如染色切片或组织块）的分析前工作流程，以保持其特性。
注：通常在实验室档案库或生物样本库中进行长时间贮存。3.27
tissueprocessor
组织处理器
用于组织固定、脱水、透明和浸蜡的自动化处理系统。3.28
确认validation
通过提供客观证据对特定的预期用途或应用要求已得到满足的认定。注：“已确认”一词用于表明相应的状态。[来源：GB/T19000一2016，3.8.13，有修改，删除了注1和注33.29
热缺血warmischemin
失去正常血液供应的组织从身体内移除前的状态。3.30
工作流程workflow
完成任务所需的一系列活动。
均质homogeneous
结构和组成均匀。
4通则
医学实验室质量管理体系的通用要求，特别是标本采集、接收和处理（包括避免交叉污染）；参见GB/T22576.1—2018中4.2、5.4.4、5.4.6或GB/T27020—2016中第8章和7.2。有关实验室设备、试剂和消耗品的要求应遵循GB/T22576.1—2018中5.3、5.5.1.2和5.5.1.3或GB/T27020—2016中6.2的要求。
GB/T42216.1—2022/IS020166-1:2018诊断工作流程的所有步骤都能影响最终分析测试结果。因此，应验证和确认整个工作流程，包括生物分子稳定性和样品贮存条件。应记录不能完全控制的工作流程步骤（如热缺血），并进行风险评估（包括对分析测试性能的潜在影响），应制定缓解措施，以实现所需的分析测试性能。因此，在设计分析测试前或期间，应进行调查研究，确保要分析的RNA谱不会以改变分析性能的方式受到影响(如进行时效试验或研究，参见附录A)。在使用标准缓冲福尔马林溶液固定组织之前，RNA谱能随着热缺血及冷缺血持续时间、福尔马林固定前的温度发生显著变化（如基因诱导、基因下调、RNA降解）。此外，这些变化在不同的供体/患者组织中可能有所不同。
通常，热缺血和冷缺血的持续时间越长，组织标本固定之前的环境温度越高，RNA谱发生变化的风险越高。
注：相较于术后冷缺血，术中热缺血能导致更明显的RNA谱变化[7,8],并且组织的起源和类型、基础疾病、手术过程、用于麻醉或治疗伴随疾病的药物及组织离体后所处的不同环境条件也能使RNA谱发生变化。热缺血不易标准化，因此应记录其持续时间。当冷缺血无法避免时（如将未经福尔马林固定的标本运送到实验室的过程），应记录其持续时间和标本容器周围的温度。当标本被运送到另个场所进行福尔马林固定时，宜记录运送持续时间和环境条件。此外，福尔马林固定以及随后的FFPE组织贮存持续时间和贮存温度会导致生物分子的修饰，并导致从FFPE组织中分离的RNA不能达到最佳分析测试性能（参见A.2.1和A.2.2）。这宜在分子分析测试的质量控制和应用中加以考虑，特别研究基因表达时[9,10,11,12]，这些效应可以限制扩增体系的cDNA靶分子大小和/或影响用于结合的cDNA靶分子的扩增引物序列。可通过优化FFPE组织分析检测或使用非交联固定液替代标准缓冲福尔马林溶液来减少分子检验中的这一问题[13,14]。关于运送和处理的安全说明应符合GB/T22576.1--2018中5.2.3和5.4.5以及ISO15190的要求。
在整个检验前过程中，应采取预防措施避免不同标本/样品之间的交叉污染，如在可行时使用一次性的材料，或在不同的标本/样品处理间隔采用适当的清洗程序。如果未按照制造商的说明使用商品，则用户应对其使用和性能负责。5实验室外部
5.1标本采集
5.1.1概述
标本采集宜考虑拟进行的分子检验的要求（如疾病状况、标本大小)(参见第6章）。参见GB/T22576.1—2018中5.4.4。5.1.2标本供体/患者的信息
文件记录应包括标本供体/患者身份信息(ID)，可以是代码形式。文件记录宜包括但不限于：
a）标本供体/患者的相关健康状况，如健康与否、疾病类型、伴随疾病、人口学信息（如年龄、性别等)；
b）组织采集前的常规医学治疗和特殊治疗信息，如麻醉剂、药物、外科手术或诊断程序；c）标本供体/患者相应的知情同意。5.1.3标本信息
文件记录应包括但不限于：
GB/T42216.1—2022/IS020166-1:2018通过记录缺血相关的血管结扎/夹闭时间点(通常为动脉夹闭时间)来表示体内缺血开始（热缺a)
血)；
组织离体的时间、日期及离体方式（如核芯针穿刺、切除及其他活检装置采样）；b)
组织类型、来源和状况（如病变组织、未受疾病影响的组织)的描述，包括外科医师、放射医师或c
病理医师在手术室内外所做的任何标记；6.2要求记录的步骤信息（适用于福尔马林固定始于实验室外部），6.3要求记录的步骤信息d)
（适用于标本病理学评估和样品选择也在实验室外部完成）。文件记录还宜包括负责收集标本的人员ID5.1.4标本处理
应执行以下步骤：
a）记录对离体标本所进行的任何添注或修整，如油墨标记、缝线、切口等标本的方位标记；b）根据适用的运送法规选择和使用容器和包装（如冷藏箱、储运箱、真空包装）；选择和使用稳定程序进行运送（如冷却）；c）
注1：组织的不正确冷冻（如错误地使用冷藏包)不但能导致组织解冻后RNA降解，而且能影响形态特征。注2：如果标本直接转移至标准缓冲福尔马林溶液中（参见6.2，特别注意固定剂用量和组织取材体积以充许固定剂充分渗透），可省略此步骤。d）容器的标记（如注册号、一维或二维条形码、标本类型，数量和器官组织来源）和附加记录信息[5.1.2、5.1.3、5.1.4a)~c)中规定的信息]。来自同一供体/患者的、具有相似特征（大体外观、组织类型、疾病状态和解剖位置）的几个标本可放人一个容器或一个容器隔室中。标本离体后，宜立即转移到容器中。容器宜置于冰上或维持温度在2℃～8℃，最大限度地减少RNA谱变化，
宜记录冷缺血期间容器周围的环境温度（如不同房间的温度、运送温度）。如果不能测量温度、温度范围宜按环境温度、室温或2℃～8℃进行大致分类。5.2运送要求
实验室应与临床或外科部门合作，共同制定有关标本运送程序的规程。应以适宜的方式进行温度监控。如果标本尚未放人标准缓冲福尔马林溶液中，宜立即置于冰上或维持温度在2℃8℃下进行即时运送，以尽量减少RNA谱的变化。注：有证据显示能通过使用真空塑料袋进一步改善置于冰上的组织的RNA谱的稳定性[15]。如果标本在实验室外部时已经放人标准缓冲福尔马林溶液，运送过程中的温度不宜超过室温。应记录与既定运送程序规程的符合性，并应描述和记录存在的任何偏离。6实验室内部
6.1关于标本接收的信息
应记录标本接收人员的ID或姓名，所接收标本到达的日期、时间及状况（如标记、包括温度在内的运送条件、组织类型和标本数量、容器泄漏/破裂）。与既定运送程序规程的任何偏离都应进行记录（参见5.2）。
注：运送过程中的温度条件会影响RNA谱和RNA质量。应核对标本标识的正确性，宜包括标本的临床信息（参见5.1.1和5.1.3）、住院号和/或捐赠者/患者6
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