GB/T 32122-2015
基本信息
标准号： GB/T 32122-2015
中文名称：牙膏中12种硝基咪唑类药物的测定高效液相色谱法及液相色谱串联质谱法
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 牙膏 硝基 咪唑类 药物 测定 高效 色谱法 色谱 串联 质谱法
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
GB/T 32122-2015.Determination of 12 nitroimidazoles in toothpaste-HPLC and HPLC-MS/MS.
GB/T 32122规定了牙膏中12种硝基咪唑类药物(如表1所示)测定的高效液相色谱法及液相色谱串联质谱法。
GB/T 32122适用于牙膏中上述12种硝基咪唑类药物的测定。
高效液相色谱法方法检出限(对所有目标物):3 μg/g,定量下限(对所有目标物):10 μg/g;液相色.谱串联质谱法检出限(对所有目标物): 0.3 μg/g ;定量下限(对所有目标物) 1 μg/g。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6379.1测量方 法与结果的准确度(正确度与精密度)第 1部分:总则与定义
GB/T 6379.2测量方法 与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分:确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法
GB/T 6682分析实 验室用水规格和试验方法
3方法要点
牙膏用饱和盐水溶液经超声及涡旋处理分散后,用乙腈(含抗氧剂)两次提取目标化合物,合并两次乙腈提取液并定容后,取部分提取液经氮吹挥干溶剂并用3%甲酸水溶液超声复溶后,过反相和阳离子混合机理固相萃取小柱,用3%甲酸水溶液淋洗柱床,用2%氨水氨化甲醇(含稳定剂)洗脱目标物,洗脱液用3%甲酸水溶液中和并定容后,涡旋混匀。用液相色谱法或液相色谱串联质谱法测定，标准曲线外标法定量。经液相色谱测试,结果为阳性的样品需经液相色谱串联质谱法进行确证。
4标准物质与试剂
除另有规定外,所用试剂均为分析纯,水为符合GB/T 6682的实验室用- .级水。
4.1乙睛:色谱纯(配制色谱流动相使用)
4.2甲酸:色谱纯(配制色谱流动相使用)
4.3甲醇
4.4 甲酸
4.5 标准物质的中英文名称,CAS号、分子式、 分子结构式及相对分子质量
GB/T 32122规定了牙膏中12种硝基咪唑类药物(如表1所示)测定的高效液相色谱法及液相色谱串联质谱法。
GB/T 32122适用于牙膏中上述12种硝基咪唑类药物的测定。
高效液相色谱法方法检出限(对所有目标物):3 μg/g,定量下限(对所有目标物):10 μg/g;液相色.谱串联质谱法检出限(对所有目标物): 0.3 μg/g ;定量下限(对所有目标物) 1 μg/g。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6379.1测量方 法与结果的准确度(正确度与精密度)第 1部分:总则与定义
GB/T 6379.2测量方法 与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分:确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法
GB/T 6682分析实 验室用水规格和试验方法
3方法要点
牙膏用饱和盐水溶液经超声及涡旋处理分散后,用乙腈(含抗氧剂)两次提取目标化合物,合并两次乙腈提取液并定容后,取部分提取液经氮吹挥干溶剂并用3%甲酸水溶液超声复溶后,过反相和阳离子混合机理固相萃取小柱,用3%甲酸水溶液淋洗柱床,用2%氨水氨化甲醇(含稳定剂)洗脱目标物,洗脱液用3%甲酸水溶液中和并定容后,涡旋混匀。用液相色谱法或液相色谱串联质谱法测定，标准曲线外标法定量。经液相色谱测试,结果为阳性的样品需经液相色谱串联质谱法进行确证。
4标准物质与试剂
除另有规定外,所用试剂均为分析纯,水为符合GB/T 6682的实验室用- .级水。
4.1乙睛:色谱纯(配制色谱流动相使用)
4.2甲酸:色谱纯(配制色谱流动相使用)
4.3甲醇
4.4 甲酸
4.5 标准物质的中英文名称,CAS号、分子式、 分子结构式及相对分子质量
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标准内容
ICS 71.100.40
中华人民共和国国家标准
GB/T 32122—2015
牙膏中12种硝基咪唑类药物的测定高效液相色谱法及液相色谱串联质谱法Determination of 12 nitroimidazoles in toothpaste-HPLC and HPLC-MS/MS
2015-10-09发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会Www.bzxZ.net
2016-05-01实施
本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起章。GB/T32122—2015
请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标由中国轻工业联合会提出：本标准由全国口腔护理用品标准化技术委员会牙旁分技术委员会(SAC/TC492/SC1)归口。本标准起草单位：大连市产品质量监督检验所（国家日化产品质量监督检验中心）、大连标准检测技术研究中心。
本标主要起草人;毛希琴、郑顺利、仟国杰、张国,李春玲,顾荣,李鹏,董广斌。1
GB/T 32122—2015
本标准规定的12种硝基咪唑类药物，我国“口腔清洁护理产品用原料规范》中规定的禁用物质，不得作为牙营生产原料即组分添加到牙膏中。如果技术上无法避免上述禁用物质作为杂质带人牙旁时，则牙音成品应符合《口腔清洁护理产品用原料规范》要求，即在正常及合理的、可预见的使用条件下，不得对人体健康产生危害。
自前我国尚未规定这些物质作为杂质存在的限量值。本标准的制定，仪对牙言中测定这些物质提供检测方法。
TYKAONiTKAca
1范围
牙膏中12种硝基咪唑类药物的测定高效液相色谱法及液相色谱串联质谱法GB/T 32122—2015
本标推规定了牙旁中12种硝基咪唑类药物（如表1所示)测定的高效液相色谱法及液相色谱串联质谱法。
本标准适用于牙育中上述12 种硝基咪唑类药物的测定。高效液相色谱法方法检出限（对所有目标物）：3μg/g，定量下限（对所有目标物）：10μg/；液相色谱串联质谱法检出限(对所有目标畅）：0.3 μg/g+定量下限(对所有目标物）1 g/g2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于木义件。凡是不注日期的引用文件，其最新版术(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（止确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3方法要点
牙育用饱和盐水溶液经超声及涡旋处理分散后，用乙睛（含抗氧剂）两次提取目标化合物，合并两次乙提取液并定容后，取部分提取液经氮吹挥干溶剂并用3%甲酸水溶液超声复溶后，过反相和阳离子混合机理固相萃取小柱，用3%中酸水溶液淋洗柱床,用2%氨水氨化甲醇（含稳定剂洗脱目标物，洗脱液用3%甲酸水溶液中和并定容后，涡旋混勾，用液相色谱法或液相色谱串联质谱法测定，标准曲线外标法定量。经液相色谱测试，结果为阳性的样品需经液相色谱串联质谱法进行确证。4标准物质与试剂
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682的实验室用一级水：4.1乙睛：色谱纯（配制色谱流动相使用）4.2甲酸：色谱纯(配制色谱流动相使用）4.3甲醇
4.4甲酸
4.5标准物质的中英文名称,CAS号分子式、分子结构式及相对分子质量见表1，
YKANirKAca
GB/T32122—2015
表1标准物质中英文名称、CAS号、分子式、分子结构式，相对分子质量序号
4-硝基
2-甲邀
-5-硝基
甲翁喔
二甲硝
落硝哒唑
塞克硝唑
6-硝基萃
并咪噬
1-甲其
-5-氧
-4 硝基
英文名称
4-nittoimidazole
2-methyl-5-
ritroimidazole
metronidazole
dimetridazole
ronidazole
Hecnidazole
6-nitrobenzimidazole
1-methyl-5-chloro-
4-nitroimidazole
tinidazple
3031-38-6
8805-1-22-2
443-18-1
551-92-8
7681-76-7
3366-95-8
94-52-0
4897-25-0
19387-91-8
分子式
C, H, N, O
C, H, N O.
Cs H,N.O.
C, H, N,Oa
C,HNQ:
C, H,CIN O.
C.HuN, O,S
相对分了质量
结构式
TYKAONrKAca
奥硝唑
原丙硝唑
苯酰甲
4.6乙腈
英文名称
amidazole
ipronidazole
benzoylmetronildazole
氨水(25%）
丁基羟基茴香醚（BHA)
乙二胺四乙酸(EDTA)二钠
氯化钠
乙腈(含抗氧剂）
表1 (缕）
分子式
16773-42-5
14885-29-1
13182-89-3
每500 mL 乙晴添加100 mg BHA(4.8),4.123%甲酸水溶液
15mL甲酸(4.4)加水定容至500 mL4.132%氮水氨化甲醇（含稳定剂）C, H. CIN,Oa
C,HuN, O.
Ch HuN,
相对分了质量
GB/T 32122—2015
结构式
10mL氮水(4.7)加甲醇(4.3)定容至500mL,加入0.0037gEDTA二钠(4.9)超声溶解，4.143%甲酸水溶液（含稳定剂)
每500mL3%甲酸水溶波(4.12)中添加0.0037EDTA二钠(4.9),超声溶解，4.15饱和盐水溶液
每 100 mL水中加人约 40 g的 NaCl 固体(1.10),充分震药溶解,穿器底部可见不溶的 NaCl晶体,上层液即为饱和盐水溶液。
4.16Strata-X-C固相萃取小柱或相当者：200mg.3mL使用前,依次用3 mL 甲醇(4.3)和3 mL3%甲酸水(1,12)活化3
TKAONIKAca
GB/T32122—2015
4.17标准贮备液（1mg/mL）
准确称取各标准物质10.0mg，用甲醇溶解定容至10.0mL。配置浓度为1mg/mL的标准储备游液，于冰箱冷藏保存。保存期3个月，4.18标准工作溶液A
临用时将标准储备液（4.1.7)用甲醇稀释成0.2g/mL，1ug/mL，5μg/m，20μg/mL，50μg/ml系列浓度的标准工作溶液，需现用现配。4.19标准工作溶液B
临用时将标准储备液（4.17)用甲醇稀释成10μg/L，20μg/L，50μg/L100μg/L，200μg/L系列浓度的标准工作溶液，需现用现配。5仪器
5.1高效液相色谱仪-二极管阵列检测器（高效液相色谱法）5.2高效液相色谱串联四级杆质谱联用仪（ESI源）（高效液相色谱串联质谱法）。5.3分析天平：感量0.1mg，0.01mg。5.4氮吹仪。
5.5漩涡混合器。
5.6超声波清洗器。
5.7离心机：转速不低于5000r/min，容量10mL。5.8移液枪或移液器。
6试样制备
牙宵样品挤山约2cm，弃去，称取0.2g（精确至0.1mg）牙膏样品于10mL具塞离心管中，加入3mL饱和盐水溶液（4.15），涡旋并超声15min，至样品完全分散，再向离心管中加入3mL含抗氧剂的乙睛(4.11)，涡旋1min～2min，充分混勾提取，5000r/min离心10min(若分层不理想可适当延长离心时间或用采用更高转速），将上层乙腈尽量移出并转入10mL刻度试管巾。向余下饱和盐水中再加人3mL乙睛（4.I1)重复提取一次，合并两次的乙情提取溶液，混匀并定容至6mL：移取3mL乙情提取液于5mL试管中，氮吹挥于乙睛后向试管中加人3mL3%甲酸水溶液（4.12)，涡旋并超声10min，确保瓶内残留物全部溶解后，将所有溶液转入Strara-X-C固相苯取小柱（4.16），待上样液全部流出后，用3mL3%中酸水溶液（4.12)淋洗柱床，最后用4mL2%氨水氢化甲醇（含稳定剂）(4.13)洗脱目标物.10mL刻度试管收集所有洗脱溶液，待所有洗脱溶液流出后，用3%甲酸水溶液（含稳定剂)（4.14），中和洗脱溶液的碱性并定容至5 mL,混句待测。
7测定
液相色谱法
7.1.1液相色谱条件
液相色谱条件为：
TTKAONTKAca
a）色谱柱：poroshell120EC-Cl8(4.6x100mm,i.d.，2.7μm)或相当者；b）流动相：A水（含0.1%甲酸）、B乙腈（含0.1%甲酸）；流速，1.0mL/min柱温：30C;进样量：5μL；c
检测波长：320nm（参比波长390nm）；液相色谱分离条件见表2）。
表2液相色谱分离条件
时间/min
定性分析
流动相A/%
GB/T32122—2015
流动相B/%
将在相同的液相色谱条件下获得的样品溶液的液相色谱分离谱图与标准物质的液相色谱分离谱图进行比较，若样品谱图中存在保留时间与某标准物质的保留时间一致的色谱峰，并且其扣除背景后的紫外吸收图谱与该标准物质的紫外吸收图谱一致，则可判断样品中存在该物质。12种硝基咪噬类药物标准物质的高效液相色谱分离谱图见附录A。7.1.3定量测定
移取系列标准溶液A（4.18），注入高效液相色谱仪中进行测定，以色谱峰的峰面积对目标化合物的浓度制作标准曲线。样品游液中目标物的含量，用标准曲线外标法确定。牙膏样品中目标物的含量X，按式(1)进行计算，结果以/g表示：X_ExV
式中：
一从标准曲线中计算出的样品溶液中目标物的质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；V
：按稀释倍数折算的被测样液总体积，单位为毫升（mI.)；称取样品的质量，单位为克（g），计算结果至少保留3位有效数字。7.1.4平行试验
按照所建立的方法操作，对同一样品独立进行测定，获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算数平均值的10%。
7.1.5回收率和精密度
本方法在10μg/g～1000ug/g添加水平范国内的平均提取回收率为85%～110%，相对标准偏5
TTKAONTKAca
GB/T 32122—20 15
差均小于 10%。
7.2液相色谱串联质谱法
液相色谱条件
液相色谱条件为：
a）色谱柱:poroshcll120 EC-C18(4.6X50 mm,i,d.,2.7μm)或相当者;流动相：A水（含0.1%甲酸）;B乙腈（含0.1%甲酸）；b）
流速：0.4mL/min;柱温：30C
进样量：2L；
液相色谱分离条件见表3。
表 3 液相色谱分离条件
间/min
质谱参考条件
质谱参考条件为：
流动柑 A/%
电离力式：电喷雾电离，正离子模式，ESI（十）；a
雾化气：氮气，35Psi；
干燥气：氮气，流速10L/min，温度：350℃;碰撞气：氮气；
毛细管电压：3500V
检测方式：多反应监测（MRM）；其他质谱条件见表4。
表412种硝基咪唑类药物的质谱采集参数药物名称
4·硝基咪唑
2-甲-5-硝基咪唑
甲硝唑
二甲硝咪唑
母离子
子离了1
（碰撑能第eV）
流动相 B/%
了离了2
（磁撞能量eV)
111.0(15)
128.2(10)
锥孔电压/V
TYKAoNrKAca
药物名称
洛硝哒唑
塞克硝唑
6-硝基苯并咪唑
1-甲基-5-氯-1-硝咪唑
替硝唑
奥硝唑
异丙硝唑
苯酰甲硝唑
定性分析
母离子
表4（续）
了离子1
（能撞能量eV）
140.0(20)
128.0(15)
118.0(25)
121.0(15)
121.0(15)
128.0(15)
109,1(20)
149,0(20)
子离子2
GB/T 32122—2015
锥孔电压/V
（碰撞能盘cV）
144.8(15)
127.9(20)
124.1(20)
105.1(35)
在同一色谱/质谱条件下进行标准落液和样品溶的测定，如果样品溶液中捡出的色谱峰的保留时间与某标准物质色谱峰蜂的保留时间一致，所选择的2对监测离子对的质荷比也一致，而且样品溶液中监测离了对的相对丰度比与相当浓度标准溶液的监测离子对的相对丰度比的偏差不超过表5规定范围，则可判定样品中存在相应的目标成分。12种硝基咪唑类药物标准物质的总离子流质谱图及提取离子(定量)质谱图参见附录B。
表5定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差相对离了本度/%
允许的相对偏差/%
7.2.4定量测定
>20～50
>10～20
移取系列标准溶液B(4.19），注人液相色谱串联质谱仪中进行测定，以色谱峰的峰面积对目标化合物的浓度制作标准曲线。样品溶液中目标物的含量，用标准曲线外标法确定。牙膏样品中目标物的含量X，按式2进行计算，结果以μg/g表示：X-CXV
式中：
从标准曲线中计算出的样品溶液中日标物的质量浓度，单位为微克每升（ug/L）；按稀释倍数折算的被测样液总体积，单位为毫升（mL）；称取样品的质量，单位为克（g)。计算结果率少保留3位有效数字。..( 2 )
对样品溶液中目标物的含量高于500/L的样品，为提高定量的准确性，建议减少进样量或适当稀释后进样，
GB/T32122—2015
平行试验
按照所建立的方法操作，对同一样品独立进行测定，获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超算数平均值的10%
回收率和精密度
参照GB/T6379.1和GB/T6379.2的方法要求，本方法在1μg/g～100μ/g添加水平范围内的平均提取回收率为85%～110%，相对标准偏差均小于10%说明：
4-硝基咪唑；
22-甲-5-硝基咪唑：
3——甲硝唑：
二甲硝唑；
5—洛硝哒唑;
塞硝唑；
附录A
（资料性附录）
12种硝基咪唑类药物标准物质的液相色谱分离谱图12
--6-硝基苯并咪噬；
{-甲基-5-氯-4-硝咪唑；
替硝唑；
奥硝唑；
异丙硝唑；
苯酰甲硝唑，
图 A,112 种硝基咪唑类药物标准物质的液相色谱分离谱图GB/T32122—2015
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中华人民共和国国家标准
GB/T 32122—2015
牙膏中12种硝基咪唑类药物的测定高效液相色谱法及液相色谱串联质谱法Determination of 12 nitroimidazoles in toothpaste-HPLC and HPLC-MS/MS
2015-10-09发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会Www.bzxZ.net
2016-05-01实施
本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起章。GB/T32122—2015
请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标由中国轻工业联合会提出：本标准由全国口腔护理用品标准化技术委员会牙旁分技术委员会(SAC/TC492/SC1)归口。本标准起草单位：大连市产品质量监督检验所（国家日化产品质量监督检验中心）、大连标准检测技术研究中心。
本标主要起草人;毛希琴、郑顺利、仟国杰、张国,李春玲,顾荣,李鹏,董广斌。1
GB/T 32122—2015
本标准规定的12种硝基咪唑类药物，我国“口腔清洁护理产品用原料规范》中规定的禁用物质，不得作为牙营生产原料即组分添加到牙膏中。如果技术上无法避免上述禁用物质作为杂质带人牙旁时，则牙音成品应符合《口腔清洁护理产品用原料规范》要求，即在正常及合理的、可预见的使用条件下，不得对人体健康产生危害。
自前我国尚未规定这些物质作为杂质存在的限量值。本标准的制定，仪对牙言中测定这些物质提供检测方法。
TYKAONiTKAca
1范围
牙膏中12种硝基咪唑类药物的测定高效液相色谱法及液相色谱串联质谱法GB/T 32122—2015
本标推规定了牙旁中12种硝基咪唑类药物（如表1所示)测定的高效液相色谱法及液相色谱串联质谱法。
本标准适用于牙育中上述12 种硝基咪唑类药物的测定。高效液相色谱法方法检出限（对所有目标物）：3μg/g，定量下限（对所有目标物）：10μg/；液相色谱串联质谱法检出限(对所有目标畅）：0.3 μg/g+定量下限(对所有目标物）1 g/g2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于木义件。凡是不注日期的引用文件，其最新版术(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（止确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3方法要点
牙育用饱和盐水溶液经超声及涡旋处理分散后，用乙睛（含抗氧剂）两次提取目标化合物，合并两次乙提取液并定容后，取部分提取液经氮吹挥干溶剂并用3%甲酸水溶液超声复溶后，过反相和阳离子混合机理固相萃取小柱，用3%中酸水溶液淋洗柱床,用2%氨水氨化甲醇（含稳定剂洗脱目标物，洗脱液用3%甲酸水溶液中和并定容后，涡旋混勾，用液相色谱法或液相色谱串联质谱法测定，标准曲线外标法定量。经液相色谱测试，结果为阳性的样品需经液相色谱串联质谱法进行确证。4标准物质与试剂
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682的实验室用一级水：4.1乙睛：色谱纯（配制色谱流动相使用）4.2甲酸：色谱纯(配制色谱流动相使用）4.3甲醇
4.4甲酸
4.5标准物质的中英文名称,CAS号分子式、分子结构式及相对分子质量见表1，
YKANirKAca
GB/T32122—2015
表1标准物质中英文名称、CAS号、分子式、分子结构式，相对分子质量序号
4-硝基
2-甲邀
-5-硝基
甲翁喔
二甲硝
落硝哒唑
塞克硝唑
6-硝基萃
并咪噬
1-甲其
-5-氧
-4 硝基
英文名称
4-nittoimidazole
2-methyl-5-
ritroimidazole
metronidazole
dimetridazole
ronidazole
Hecnidazole
6-nitrobenzimidazole
1-methyl-5-chloro-
4-nitroimidazole
tinidazple
3031-38-6
8805-1-22-2
443-18-1
551-92-8
7681-76-7
3366-95-8
94-52-0
4897-25-0
19387-91-8
分子式
C, H, N, O
C, H, N O.
Cs H,N.O.
C, H, N,Oa
C,HNQ:
C, H,CIN O.
C.HuN, O,S
相对分了质量
结构式
TYKAONrKAca
奥硝唑
原丙硝唑
苯酰甲
4.6乙腈
英文名称
amidazole
ipronidazole
benzoylmetronildazole
氨水(25%）
丁基羟基茴香醚（BHA)
乙二胺四乙酸(EDTA)二钠
氯化钠
乙腈(含抗氧剂）
表1 (缕）
分子式
16773-42-5
14885-29-1
13182-89-3
每500 mL 乙晴添加100 mg BHA(4.8),4.123%甲酸水溶液
15mL甲酸(4.4)加水定容至500 mL4.132%氮水氨化甲醇（含稳定剂）C, H. CIN,Oa
C,HuN, O.
Ch HuN,
相对分了质量
GB/T 32122—2015
结构式
10mL氮水(4.7)加甲醇(4.3)定容至500mL,加入0.0037gEDTA二钠(4.9)超声溶解，4.143%甲酸水溶液（含稳定剂)
每500mL3%甲酸水溶波(4.12)中添加0.0037EDTA二钠(4.9),超声溶解，4.15饱和盐水溶液
每 100 mL水中加人约 40 g的 NaCl 固体(1.10),充分震药溶解,穿器底部可见不溶的 NaCl晶体,上层液即为饱和盐水溶液。
4.16Strata-X-C固相萃取小柱或相当者：200mg.3mL使用前,依次用3 mL 甲醇(4.3)和3 mL3%甲酸水(1,12)活化3
TKAONIKAca
GB/T32122—2015
4.17标准贮备液（1mg/mL）
准确称取各标准物质10.0mg，用甲醇溶解定容至10.0mL。配置浓度为1mg/mL的标准储备游液，于冰箱冷藏保存。保存期3个月，4.18标准工作溶液A
临用时将标准储备液（4.1.7)用甲醇稀释成0.2g/mL，1ug/mL，5μg/m，20μg/mL，50μg/ml系列浓度的标准工作溶液，需现用现配。4.19标准工作溶液B
临用时将标准储备液（4.17)用甲醇稀释成10μg/L，20μg/L，50μg/L100μg/L，200μg/L系列浓度的标准工作溶液，需现用现配。5仪器
5.1高效液相色谱仪-二极管阵列检测器（高效液相色谱法）5.2高效液相色谱串联四级杆质谱联用仪（ESI源）（高效液相色谱串联质谱法）。5.3分析天平：感量0.1mg，0.01mg。5.4氮吹仪。
5.5漩涡混合器。
5.6超声波清洗器。
5.7离心机：转速不低于5000r/min，容量10mL。5.8移液枪或移液器。
6试样制备
牙宵样品挤山约2cm，弃去，称取0.2g（精确至0.1mg）牙膏样品于10mL具塞离心管中，加入3mL饱和盐水溶液（4.15），涡旋并超声15min，至样品完全分散，再向离心管中加入3mL含抗氧剂的乙睛(4.11)，涡旋1min～2min，充分混勾提取，5000r/min离心10min(若分层不理想可适当延长离心时间或用采用更高转速），将上层乙腈尽量移出并转入10mL刻度试管巾。向余下饱和盐水中再加人3mL乙睛（4.I1)重复提取一次，合并两次的乙情提取溶液，混匀并定容至6mL：移取3mL乙情提取液于5mL试管中，氮吹挥于乙睛后向试管中加人3mL3%甲酸水溶液（4.12)，涡旋并超声10min，确保瓶内残留物全部溶解后，将所有溶液转入Strara-X-C固相苯取小柱（4.16），待上样液全部流出后，用3mL3%中酸水溶液（4.12)淋洗柱床，最后用4mL2%氨水氢化甲醇（含稳定剂）(4.13)洗脱目标物.10mL刻度试管收集所有洗脱溶液，待所有洗脱溶液流出后，用3%甲酸水溶液（含稳定剂)（4.14），中和洗脱溶液的碱性并定容至5 mL,混句待测。
7测定
液相色谱法
7.1.1液相色谱条件
液相色谱条件为：
TTKAONTKAca
a）色谱柱：poroshell120EC-Cl8(4.6x100mm,i.d.，2.7μm)或相当者；b）流动相：A水（含0.1%甲酸）、B乙腈（含0.1%甲酸）；流速，1.0mL/min柱温：30C;进样量：5μL；c
检测波长：320nm（参比波长390nm）；液相色谱分离条件见表2）。
表2液相色谱分离条件
时间/min
定性分析
流动相A/%
GB/T32122—2015
流动相B/%
将在相同的液相色谱条件下获得的样品溶液的液相色谱分离谱图与标准物质的液相色谱分离谱图进行比较，若样品谱图中存在保留时间与某标准物质的保留时间一致的色谱峰，并且其扣除背景后的紫外吸收图谱与该标准物质的紫外吸收图谱一致，则可判断样品中存在该物质。12种硝基咪噬类药物标准物质的高效液相色谱分离谱图见附录A。7.1.3定量测定
移取系列标准溶液A（4.18），注入高效液相色谱仪中进行测定，以色谱峰的峰面积对目标化合物的浓度制作标准曲线。样品游液中目标物的含量，用标准曲线外标法确定。牙膏样品中目标物的含量X，按式(1)进行计算，结果以/g表示：X_ExV
式中：
一从标准曲线中计算出的样品溶液中目标物的质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；V
：按稀释倍数折算的被测样液总体积，单位为毫升（mI.)；称取样品的质量，单位为克（g），计算结果至少保留3位有效数字。7.1.4平行试验
按照所建立的方法操作，对同一样品独立进行测定，获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算数平均值的10%。
7.1.5回收率和精密度
本方法在10μg/g～1000ug/g添加水平范国内的平均提取回收率为85%～110%，相对标准偏5
TTKAONTKAca
GB/T 32122—20 15
差均小于 10%。
7.2液相色谱串联质谱法
液相色谱条件
液相色谱条件为：
a）色谱柱:poroshcll120 EC-C18(4.6X50 mm,i,d.,2.7μm)或相当者;流动相：A水（含0.1%甲酸）;B乙腈（含0.1%甲酸）；b）
流速：0.4mL/min;柱温：30C
进样量：2L；
液相色谱分离条件见表3。
表 3 液相色谱分离条件
间/min
质谱参考条件
质谱参考条件为：
流动柑 A/%
电离力式：电喷雾电离，正离子模式，ESI（十）；a
雾化气：氮气，35Psi；
干燥气：氮气，流速10L/min，温度：350℃;碰撞气：氮气；
毛细管电压：3500V
检测方式：多反应监测（MRM）；其他质谱条件见表4。
表412种硝基咪唑类药物的质谱采集参数药物名称
4·硝基咪唑
2-甲-5-硝基咪唑
甲硝唑
二甲硝咪唑
母离子
子离了1
（碰撑能第eV）
流动相 B/%
了离了2
（磁撞能量eV)
111.0(15)
128.2(10)
锥孔电压/V
TYKAoNrKAca
药物名称
洛硝哒唑
塞克硝唑
6-硝基苯并咪唑
1-甲基-5-氯-1-硝咪唑
替硝唑
奥硝唑
异丙硝唑
苯酰甲硝唑
定性分析
母离子
表4（续）
了离子1
（能撞能量eV）
140.0(20)
128.0(15)
118.0(25)
121.0(15)
121.0(15)
128.0(15)
109,1(20)
149,0(20)
子离子2
GB/T 32122—2015
锥孔电压/V
（碰撞能盘cV）
144.8(15)
127.9(20)
124.1(20)
105.1(35)
在同一色谱/质谱条件下进行标准落液和样品溶的测定，如果样品溶液中捡出的色谱峰的保留时间与某标准物质色谱峰蜂的保留时间一致，所选择的2对监测离子对的质荷比也一致，而且样品溶液中监测离了对的相对丰度比与相当浓度标准溶液的监测离子对的相对丰度比的偏差不超过表5规定范围，则可判定样品中存在相应的目标成分。12种硝基咪唑类药物标准物质的总离子流质谱图及提取离子(定量)质谱图参见附录B。
表5定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差相对离了本度/%
允许的相对偏差/%
7.2.4定量测定
>20～50
>10～20
移取系列标准溶液B(4.19），注人液相色谱串联质谱仪中进行测定，以色谱峰的峰面积对目标化合物的浓度制作标准曲线。样品溶液中目标物的含量，用标准曲线外标法确定。牙膏样品中目标物的含量X，按式2进行计算，结果以μg/g表示：X-CXV
式中：
从标准曲线中计算出的样品溶液中日标物的质量浓度，单位为微克每升（ug/L）；按稀释倍数折算的被测样液总体积，单位为毫升（mL）；称取样品的质量，单位为克（g)。计算结果率少保留3位有效数字。..( 2 )
对样品溶液中目标物的含量高于500/L的样品，为提高定量的准确性，建议减少进样量或适当稀释后进样，
GB/T32122—2015
平行试验
按照所建立的方法操作，对同一样品独立进行测定，获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超算数平均值的10%
回收率和精密度
参照GB/T6379.1和GB/T6379.2的方法要求，本方法在1μg/g～100μ/g添加水平范围内的平均提取回收率为85%～110%，相对标准偏差均小于10%说明：
4-硝基咪唑；
22-甲-5-硝基咪唑：
3——甲硝唑：
二甲硝唑；
5—洛硝哒唑;
塞硝唑；
附录A
（资料性附录）
12种硝基咪唑类药物标准物质的液相色谱分离谱图12
--6-硝基苯并咪噬；
{-甲基-5-氯-4-硝咪唑；
替硝唑；
奥硝唑；
异丙硝唑；
苯酰甲硝唑，
图 A,112 种硝基咪唑类药物标准物质的液相色谱分离谱图GB/T32122—2015
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