HG3617-1999
本标准是根据我国以往制定的苏云金杆菌企业标准等有关材料，结合我国实际情况而制定的。本标准对苏云金杆菌可性粉剂的要求、试验方法、抽样以及包装、运输等作了具体要求和规定，从面为苏云金杆菌的生产提供了统一的技术依据。本标准由中华人民共和国原化学工业部技术监督司提出。本标准由化学工业部沈阳化工研究院归口本标推主要起草单位：中国农业大学应用化学系。本标准参加起草单位：湖北省生物农药工程研究开发中心、济南科贝尔生物工程有限公司。本标准主要起草人：刘丰茂、王开梅、钱传范、钟连胜、赵欣昕、王缔文。1166
中华人民共和国化工行业标准
苏云金杆菌可湿性粉剂
Bacillus thuringiensis wettable powderHG 36171999
苏云金杆菌（Bacillusthuringiensis，B.t.）是目前应用最广泛的一种微生物杀虫剂，它的主要杀虫成分是伴孢晶体中的毒素蛋白，其中，对鳞翅目有毒力的蛋白相对分子质量为130000。1范围
本标准规定了苏云金杆菌可湿性粉剂的要求、试验方法以及标志、标签、包装、贮运。本标准适用于由苏云金杆菌原药和助剂等制成的苏云金杆菌可湿性粉剂，主要用于防治鳞翅目害虫。
2引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标推的条文。本标准出版时，所有版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/T1250--1989极限数值的表示方法和判定方法GB/T1600—1979（1989）农药水分测定方法GB/T1601-1993农药pH值的定方法GB/T1604—1995商品农药验收规则GB/T1605—1979（1989）商品农药采样方法GB3796—1983农药包装通则
GB/T5451-1984农药可湿性粉剂湿润性测定方法GB/T14825--1993农药可凝性粉剂悬浮率测定方法农药粉剂、可凝性粉剂细度测定方法GB/T16150--1995
9苏云金杆菌原粉
HG3616—1999
3要求
3.1外观：灰白色至棕褐色疏松粉末，不应有团块。3.2苏云金杆菌可湿性粉剂应符合表1要求。表1苏云金杆菌可湿性粉剂控制项目指标项
毒素蛋白,%
事力效价（[PxFU/mg】[Ha.IU/mg])pH值
细度（75μm），%
国家石油和化学工业眉1999-06-.16.批准32000IU/mg
32 000
16000IU/mg
8000TU/mg
2000-06-01实施
悬浮率(有效成分)，%
涩润时间，min
水分，%
HG3617-1999
表1（完）
32000IU/mg
16000IU/mg
注：Px和Ha分别为小菜蛾（Plutellaxylostella）和棉铃虫（Heliothisarmigera）的缩写。4试验方法
除另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，所述溶液均为水溶液。4.1抽样免费标准下载网bzxz
8000IU/mg
按照GB/T1605一1979(1989）中第五章“粉剂和可湿性粉剂的采样”进行，用随机数表法确定抽样的包装件。最终抽样爱应不少于100g。4.2鉴别试验
当用生物测定法检测产品质量产生疑问时，可用以下方法进行鉴定。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)方法测定有效毒素蛋白的相对分子质是否为130000，并同时测定囊素蛋白含量是否符合3.2指标的规定。4.3素盈白含量的测定
毒素蛋白含量可以用SDS-PAGE-扫描法和SDS-PAGE-洗脱比色法两种方法进行测定，二者糖密度、准确度接近，前者由于自动化程度更高，而定为仲裁法。4.3.1SDS-PAGE-扫描法（仲裁法）4.3.1.1方法提要
用碱性溶液处理苏云金杆菌可湿性粉剂伴孢晶体，使其降解为毒素蛋白，然后通过SDS-PAGE，依蛋白质相对分子质量的差异，使齊素蛋白与其他杂蛋白分离，之后用薄层扫描仪或电泳图像扫描仪扫描蛋白区带面积，进行定量。
4.3.1.2仪器、设备
电泳仪。
夹芯式垂直电泳（1.5mm凹形带槽橡胶模框）、凝胶板面积145mm×100mm（1.5mm、12孔样品槽模具）。
离速薄层层析扫描仪或电泳图像扫描仪。离心机：10000r/min。
分析天平：精确至0.0001g。
4.3.1.3试剂和溶液
过硫酸铵（AP）。
十三烷基硫酸钠（SDS）。
四甲基乙二胺(TEMED)。
氢氧化钠。
30%丙两烯酰胺：称取丙烯酰胺30g，亚甲基双丙烯酰胺（原称：甲叉双丙烯酰胺）0.8g，溶于100mL燕馏水中，过滤，于4℃暗处贮存备用。1.mol/L、PH8.8三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲液：称取三羟基氮基甲烷30.25名溶于蒸馏水中，用浓盐酸调至pH8.8，用蒸馏水定容至250mL。1mol/L、PH6.8三羟基氨基甲烷-HC1缓冲液：称取三羟基氨基甲烷12.10g溶于蒸馏水中，用浓1168
HG3617—1999
盐酸调至pH6.8，用蒸馏水定容至100mL。电极缓冲液：称取三羟基氨基甲烷3.03g，甘氨酸14.42g，十二烷基硫酸钠1g，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。
3×样品稀释液：1mol/L、PH6.8三羟基氮基甲烷-HC118.75mL，十二烷基硫酸钠6g，甘油30mL，巯基乙醇15mL，少许澳酚蓝，用蒸馏水定容至100mL。染色液：称取考马斯亮蓝（CBB）R-2501g，加入甲醇450mL，冰乙酸100mL，蒸馏水450mL，溶解过滤后使用。
脱色液：量取甲醇100mL，冰乙酸35mL，用蒸馏水定容至1000mL。漂洗液：量取无水乙醇30mL，冰乙酸10mL，蒸馏水60mL，混合均匀后使用。毒素蛋白标样：素蛋白（相对分子质为130000）含为9.3%的原粉。4.3.1.4试样处理
称取标样、试样各20mg（准确至0.1mg），移至5mL离心管中，加2mL水充分悬浮。然后加人0.55mol/L氢氧化钠溶液0.45mL（使氢氧化钠溶液的终浓度为0.1mol/L），放置约5min，再加人3×样品稀释液1.30mL，使最终体积为3.75mL，于100℃沸蒸馏水中煮6min，离心（2000r/min）10min后取上层清液，以备电泳上样，4.3.1.5SDS-PAGE分离囊素蛋白
a）制备8%~10%骤两烯胺凝胶
采用不连续缓冲系统，制胶方法见HG3616一1999附录A（提示的附录）。b）上样
取上述标样溶解上层清液，于聚丙烯酰胺凝胶的上样孔中分别上样6、8、10、12、14μL（毒素蛋白含量约为3～7μg），作为标准曲线，再取一定体积的试样溶液上层清液（素蛋白含约为5ug），加入到上样孔中，注入电极缓冲液后，接通电源。c）电泳
电泳初期电压控制在100V左右，待试样进入分离胶后，加大电压到120V，继续电泳，当示剂前沿到达距底端1cm左右时停止电泳，取出胶板，在7.5%（体积百分数）乙酸中漫泡30min。d）染色
将分离胶部分取下，用考马斯亮蓝(CBB)R-250染色液染色过夜。e）脱色
倒去染色液，先用漂洗液洗涤凝胶，然后加入脱色液，于37℃下加热使其脱色，更换几次脱色液，直至背景清晰为止。
4.3.1.6测定
胶板经脱色后，可清晰地看到130000蛋白区带，用高速薄层层析扫描仪或电泳图像扫描仪扫描该区带，扫描波长为600nm。
样品中毒素蛋白的百分含（X）按式（1)进行计算。X-
式中：m1——从标准曲线上查得的样品中素蛋白的量，ug;mg——2 mL稀释液中样品的质量,mgVi—样品最终定睿体积，mL（3.75mL），V.——注人凝胶上样孔的样品体积，L。4.3.1.7允许差
取其算术平均值为测定结果。两次平行测定结果相对偏差小于等于8%。4.3.2SDS-PAGE-洗脱比色法
·（1）
4.3.2.1方法提要
HG3617—1999
用碱性溶液处理苏云金杆菌可湿性粉剂伴孢晶体，使其降解为薄素蛋白后，通过SDS-PAGE，依白质相对分子质量的异，使毒素蛋白与其他杂蛋白分离，再割胶，洗脱，定吸光度。4.3.2.2仪器、设备
分光光度计。
其他同4.3.1.2。
4.3.2.3试剂和溶液
吡啶。
其他同4.3.1.3。
4.3.2.4试样处理
间43.1.4。
4.3.2.5SDS-PAGE分离毒素白
a）制备8%~10%聚两烯酰胺诞胶
同4.3.1.5a)。
b）上样
取上述标样溶液上层清液，于上样孔中分别上样15、20、30、40、50证（毒素蛋白含量约为.7.5～25μg)。作为标准曲线，再取一定体积的试样溶液上腰清液(毒素蛋白含量约为15 μg），加入到上样孔中，注人电极缓冲液后，接通电源。c）电泳
同4.3.1.5c)。
d）染色
同4.3.1.5d)。
e）脱色
同4.3.1.5e）。
4.3.2.6測定
用手术刀刮下待测区带，放于玻璃试笛中，再加25.%吡啶（体积百分数）3.0mL，于37℃下振荡洗脱毒素蛋白所吸附的考克斯亮蓝（CBB)R-250，平衡后用分光光度计，以25%吡啶为参比，于605nm下，测定溶液的吸光度，用式(1)计算毒素白含量。4.3.2.7允许差
取其算术平均值为測定果。两次平行测定结果相对偏小于等于8%。4.4事力效价的测定
按HG3616—1999附录B(标准的附录）进行。4.5pH值的测定
按GB/T1601进行。
4.6细度的测定
按GB/T16150—1995中2.2进行测定。4.7悬浮率测定
4.7.1操作步骤
称取样品200.0mg（糖确到0.1mg），放入盛有玻璃珠的三角瓶冲，加入标推硬水100mL，用手左右振荡60次。制得的悉浮液全部转移到250mL具塞量简中，用标准硬水稀释到250mL。按GB/T14825--93中3.1进行。
4.7.2计第
悬浮率(Y)按式(2)计算：
HG3617—1999
Y = 111. 1(C - Q)
式中：C配置悉浮液所取试样的毒力效价，IU，Q-留在量简底部的25mL悬浮液的薄力效价，IU。4.7.3允许差
二次重复测定结巢之蒸应不过10%。4.8凝润时间的测定
按GB/T5451进行。
4.9水分的测定
按GB/T16001979(1989)中“共沸蒸馏法”进行测定。5检验规则
应符合GB/T1604有关规定。极数值按GB/T1250处理。6标患、标签、包装、贮运
6.1产品包装应符合GB3796规定，并应注明所用标准编号。6.2可性粉剂产品主要采用翘料袋包装，密封。6.3贮存时严防日晒，勿受压，置于阴干燥处。6.4运输时，注意轻放，防止损坏。.（2)
6.5保证期：在正常贮运条件下，可湿性粉剂的质量保证期从生产日期算起为二年，产品出厂时群力效价和牵素蛋白含量不低于3.2指标，两年内产品紊力效价和幕衰蛋白含量均不低于3.2指标的70%。1171
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