本标准规定了落叶松种鉴定的具体实验方法。本标准适用于利用随机扩增多态性DNA(RAPD)法对落叶松种子鉴定的实验过程。 GB/T 19564-2004 落叶松种子鉴定实验方法 随机扩增 多态性DNA法 GB/T19564-2004 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS 65.020.20
中华人民共和国国家标准
GB/T 19564--2004
落叶松种子鉴定实验方法
随机扩增多态性DNA法
Experimental identification method for species of larch seedRAPD2004-06-22发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2004-12-01实施
本标准的附录A为规范性附录，
本标准由国家质基监督检验检疫总局提出。GB/T19564—2004
本标准起草单位：国家农业标准化监测与研究中心（黑龙江）、黑龙江省质量技术监督局。本标准主要起草人：王庆贵、徐晶、姜雯、李光宇、石绍业、主卫国。iiKAoNiAca
GB/T19564-2004
前，我国林木种子的鉴定多艰用感官将定、理化水平鉴定等方法。这些方法所需的检验周期较长，不具备分了水乎整定的诺多优点。随着分子生物学的发展，特别是20世纪90年代以来，分子生物学的相关技术已被广泛应用，其检测对象为TNA大分子一一生物的遗传基础。以L)NA为检测对象，具有许多其他检测水平所不具备的优点：首先，可供探测DNA标记的数量可能是无限的，这是间E酶技术所无法比拟的：其二，DNA分析技术不像其他技术那样随组织或发育阶段面异，植物体任何部位，仟何时期提供的DNA均可用于分析，其检测结果都是样的，第三，LNA分析不受境影响·其变异只源于等位基因DNA序列的变异，这种稳楚性便于揭示品种间的迪传变并，从而排除了环境变异所造成的表型变异。基于L述优点，DVA分析技术是农，林、牧、渔等品种鉴定的先进方法。1范圈
落叶松种子鉴定实验方法
随机扩增多态性 DNA 法
本标准规定了落叶松种子鉴定的具体实验方法。GB/T19564—2004
本标准适用于利用随机扩增多态性DNA(RAPD)法对落叶松种子鉴定的实验过程。2术语、定文和缩略语
2.1术语和定义
下列术语和定义适用于本标推。2.1.1
桑合酶链式反应polymerase chain reaction--种可以从少最至.个拷贝的特定碱基顺序的DWA片断在体外花费儿个小时即可扩增出数百万个分子的酶摧化反应,即 DNA 合成反应。2. 1.2
随机扩增多态性DNArandomamplifled polymorphleDNA是以聚合酶链式反应为基础，用随机排列的寡紊脱氧核苷酸单链作为引物扩增基因组中不同位点的IDNA，进而揭示多个位点等位基因间多态性的一种分子标记疗法。2. 1.3
核苷酸nucleotide
是构成核酸的基本单元，由三部分组成；五碳糖、磷酸和环状的含抵碱基。2. 1. 4
引物 primer
一条互补结合在模板 DNA链上的短的单链,提供 3'-OH 端作为 DNA 合成的起点,延伸合成模板DNA的互补链。
多态性polymorphism
一对引物在两个或两个以上不同材料基因组DNA之间扩增，得到数自不同或长度不同的DNA片断。
2.2缩略语
下列缩略语适用于本标准。
RAPD随机扩增多态性DNA(RandomAmplifiedPolymorphismDNA)PCR聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）DNA脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid)OD光密度（OpticalDensity）
RNA核糖核酸(Ribonucleic Acid)TBE 三羟基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸一钠(Tris Boric-acid EDTA)KAONiKAcabzxz.net
GB/T19564—2004
3实验方法
3.1原理
DNA是生物体的遮传物质，携带所有的逆传息，质DNA分子水平上进行鉴别是区分物种、品种基至个体之间差异的最为有效的方法。利用PCR技术再以将DNA片段在短时间内扩增几f甚至儿百万倍，从而达到可以检测的目的。RAPD方法是在PCR技术基础上采用随机核替酸序列作为引物，扩增基因组DNA，这些扩增的DNA片段多态性便反应了基因组相应区城IDNA的多态性，报据扩增片断长度和片断多少所表现的差异，鉴定某一物种和品种。
3.2环境条件
a）温度.15℃～25℃，
b）相对湿度：相对湿度（RH)不大于50%。3.3仪器
a）PCR扩增仪；
b）紫外分光光捷计：
高速台式离心机：转速不小于150001/minld）多用电泳仪及水平式电泳槽；e）
紫外遗射仪主
微量移液器：规格为0.1μL~2.5μL、2μL-20μL、20xL200μL,100μL1000μLf
电子天平：分度值为0.000 1各#g）
磁力加热搅拌器：
凝胶成像系统；
超纯水系统；
k）灭菌锅，
酸度计：最大允许误差为±0.1pHm）
徽波炉
n）恒温水浴锅：最大允许误差为士1C；o）恒温干燥箱，最大允许误差为士1℃。3.4试剂和耗材
3.4.1试剂
）TagDNA聚合酶i保存条件为一20℃主2；b）10×Buffer:保存条件为—20=2℃：四种脱氧核苷酸（4×dNTP）：保存条件为一20℃土2℃d）Mg2+：保存条件为20℃±2℃；RNA酶（无DNA酶）：保存条件为→20℃士2Ce)
琼脂糖（agarose）)：
g）羟甲基氮基甲烷(Tris)分子式为 C4HnNO,乙二胺四乙酸二钠（EDTANa·2HzO)：分子式为CeHuN,OaNaz·2H,Oh)
澳酚蓝(bromphenol blue sodium salt):分子式为 CiH,Br, O, SNa ;）二甲苯青FF(xylenecyanoleFF）：分子式为CsHNzOS,Nak）8-羟基喹啉（hydroxyyuinoline)：分子式为CH,NO：1)
十二烷基磺酸钠(SDS):分子式为 CHasO,SNa;m）
瘦化乙锭(EB)分子式为 C;HN,Brn）异茂醇:分子式为 C,HlOH;
结晶（pheno1).分子式为CH。O，保存条件为一20℃土2℃；p）三氯甲烷：分子式为CHCls，纯度为分析纯g)
翻酸（boricacid)：分子式为H,BOs纯度为分析纯；r）蔗糖（sucroe):分子式为 C:H22Oi纯度为分析纯;无水乙醇，分子式为CH,OH，纯度为分析纯，s）
盐酸：分子式为HCI，纯度为分析纯氟化钠：分子式为NaCI,纯度为分析纯；u)
v）水:分子式为 H,0。本实验所用水均为去离子水。3. 4.2耗材
GB/T 19564—2004
a）离心管：规格为 1.5 mL、0.2 rnL，使用前需进行高压荧（按第 A.1章中规定的方法进行操作)：
研体:规格为直径 7 cm~10 cm
c）移液器吸头：规格为20μL、200μI,和1(00μL。使用前需进行高压灭菌：d)
容量瓶：规格为100mL，1000mL;烧杯：规格为100ml-:
）三角烧瓶：规格为250ml；
g）PE手套，
h）辐韬纸；
）封口膜。
3.5实验程序
3. 5. 1 DNA 的提取
3.5.1.1取落叶松种子5粒~8粒，放在1.5ml.离心管中，加入600μL勾浆缓冲液（按第A.2章中规定的方法进行配制）浸泡2h，倒人研钵中充分研磨，将研磨产物倒入1.5mL离心管中，取少量勾浆缓种液冲洗研钵，一并倒人离心管中,离心(转速为 4 000 r/ min)10 min,将上清液移至新的 1. 5 mL 离心管中,弃沉淀。
3.5.1.2加入与上清液等体积的饱和酚（按第A.3章中规定的方法进行配制），缓频倒离心管20 min，避免捌烈振满。
3.5.1.3离心转速为8000r/min)10min将上清液移至新的离心管中。3.5.1.4加人与上清被等体积的酚-三氟甲烷-异戊醇（体积比为24：23=1），离心（转速为8 000 r/min)10 min,将上清移至新的离心管中。3.5.1.5加人与上满液等体积的三氧甲烷-异戏醇（体积比为23：1），缓慢颠例10min，离心（转速为8 00心 r/min)10 min,取上清液至新的离心管中。3.5.1.6加人上清液二倍体积的冰冷乙醇，水平旋转离心管50100圈，即可出现白色絮状DNA。3.5.1.7将离心管置于=20℃冰箱中30min，取后离心（转速为8000r/min)10min.形成白色沉淀。3.5.1.8衡掉离心管中的铱体，加入 1 mL75%乙醇，离心(转速为 15 000 z/min)5 min，倒掉乙醇，倒暨在节净的啵水纸上，吸干液体。3.5.1.9将离心管置于恒温干燥箱（40℃50℃）中20min或置于通风处40min，使乙醇挥发。3.5.1.10加入100)uI.TF缓冲液（按第A.4章中规定的方法进行配制)和RNA酶2μL（按第A.5章中规定的方法进行配制）,水浴(55士2℃)12 h,使DNA沉淀充分溶解，4C冰籍中保存。3.5.2DNA浓度的捡测
3.5.2. 1掌外吸收检测
DNA分子中的嗪呤环和嘧啶环能够吸收紫外光。DNA的紫外吸收高峰在波长 260 nm 处，蛋自质的吸收高蜂在波长280nm处。取3.5.1中提取的DNA溶液5μL，加水095μL，放人比色杯中，用TiKAMiKAca
GB/T19564-2004
紫外分光光计检測,记下 260 nm 和 280 nm 下的 OD值,计算出 DNA 的浓度以及 ODz和 OD28的比值。DNA的OD2u/OD最好在1.8左右，1.5以上也可用于RAPD-PCR分析，若比值太小应重复3.5.1.2~3.5.1.10步骤继续抽提。DNA 浓度按公式(1)计算;
D=50×100×ODauXs
式中;
D-—DNA的浓度,单位为纳克每微升(ng/μL);s稀释倍数。
3.5.2.2凝胶电泳检测
将制备好的浓度为门，7必的谅脂糖凝胶（按第A，6章中规定的方法进行配制）放人电泳插中，使点样孔处于电源负极端,加人恰好没过胶面 1 ImM 深的足量电泳缓冲液(0. 5×TBE)(按 A.6. 3 中规定的方法进行配制）。取DNA溶液10μL和凝胶样缓冲液（按第A.7章中规定的方法进行配制)2μL，在封口膜上用微量移液器上下吸打混匀，加入到点样孔中（避免出现气泡）。打开电源，将电压控制在5V/cm，电泳1h，取出凝胶，放在紫外透射仪上观赛。若DNA质量好、分子量离（>50玉b)且无降解，则店在点样孔附近星现一致密充带，若DNA部分降解，则晕连续分布状态：若严重降解，则看不到大片段 DNA，只能在远离如样孔的地方着到 RNA。3.5.3RAFD 扩增
3. 5. 3. 1反应成分
25μL反应体系中，含有1×Buffer,1,5ttnal/LMg+,200μnol/LdNTP,1UTaDNA聚合酶，1μmol/L引物,100 n毫模板 DNA，加水至 25 L(各反应成分的配制按第 A,8 章中规定的方法进行)。按主述比例将反应液依次加人O.2mL离心管中，放人PCR仪中，进行PCR循环。3.5.3.2循环过程
循环过程如图1所示：
94C预变性 5 min
94℃变性 1 min
36℃谌火 1 min
72℃延伸 1 min
72℃延伸10 tnin
4℃冷却
40个循环
图1PCR反应循环过程示意圈
3.5.3.3电泳检测
将制备好的浓度为2%琼脂糖凝胶（按第A.6紊中规定的方法进行配制）放人电泳撒中，使点样孔处于电源负极端。取PCR扩增产物10L和避胶样經冲液（按第A，7章中规定的方法进行配制）2L，在封口膜上用微量移液器上下吸打混勾，加人到点样孔中（避免出现气泡）。打开电源将电压控制在 3 V/cr,电泳 3 h,取出凝胶，在凝胶成像上扫描。3.5.3.4监鉴定
将待测种了的凝胶成像绪果与该品种的各分布区种子的标准谱带比较，从而鉴定出该品种的真实性。
A、1高压爽菌的操作方法
附录A
（规范性附录）
灭菌方法及缓冲液和主要试剂的配制CB/T19564—2004
将欲灭菌的离心臂放入烧杯中，用锡箱纸封口；移液器吸头装在吸头盒内：配好的试剂装人试剂瓶中，益好盖，放人灭菌锅中。首先将压力升至1Pa，放气，再将压力重新升至1Pa，开始计时，20min后，将电源关闭。待压力为零时，取出离心警、吸头及试剂瓶，待用。A.2匀浆缓冲液的配制
取1mol/1.Tris·CI(pH8.0)200mL、0.5mol/LEDTA(pH8.0)50mL和0.5gSDS,加水至100L。使用前应保证SDS充分溶解，茗出现结晶，应放在50℃水浴中溶解10min。A,2. 1 1 mal/L Tris ? Cl(pH8. 0):称取 12. 11 名 Tris,溶于 80 mL 水中,用浓 HCl 调节溶液的 pH 值室 8. 0,加水定容至 100 tml..高压灭菌。A.2.2 0. 5 mol/L EDTA(pH8.0):称取 18,61 g EDTANaz2H2O,溶于 80 mL水中,在磁力加热搅拌器剧烈揽拌，用NaOH（约需2g左右）调节溶被的pH值至8.0，加水定容至100mL高压灭菌。A.3饱和的制备
饱和酚的制备宜在通风概或通风良好的条件下进行。A.3.1将室温下的酚置于60℃水浴中融化，然后倒人蒸馏器中加热，在180℃左右搜集液体。经重蒸的酚分装贮存于··20它冰箱中备用。A3.2将重蒸酚60℃水浴中融化后，加入8-羟基喹啉达到终浓度0.1%，加人等体积0.5moi/LT'ris-CI(pH8.0)溶液，用磁力加热搅拌器混勾后静止-段时间，移出上层水相，重复此过程，直到相的pH值大于7.8时，即为饱和酚溶液，装人棕色瓶中，4℃冰箱中妙存。A,4TE缓冲液的配制
取 1 mol/L Tris -Cl(pH7. 6)1 mL,0. 5 mol/I. FDTA(pII8.0)0,2 mL,加水至 100 mLs4.4.11mol/1Tris·Cl(pH7.6)：称取12.11Tris+溶于80mL水中，用浓HC调节溶较的pH值至 7.6,加水定穿至 100 tniL,高压灭菌。A 4. 2 0. 5 mol/L EDTA(pH8. 0): 间 A. 2. 2A. 5 RNA 酶(10 mg/mL)的配制
称取RNA酶1mg.溶手100uTE缓冲中，水裕（70℃）10min缓慢冷却至室温。A, 6琼脂糖凝胶的配制
配制浓度为0.7%(或2%)的琼脂糖凝胶需称取琼脂糖0.7g(或2g)置于200ml.三角瓶中，溶于100mL0.5×TBF中，在微波炉中溶化至溶液透明，冷都至50℃60℃，期人溴化乙锭（10mg/mI.），调至终浓度为0.5ug/mL，混句后将凝胶倒人已封口并放好梳子（距底板1.0II左右）的载胶板上，凝胶厚度在3mm～5mm为宜.待凝胶完全避固后放入电泳槽中备用。A6.1溴化乙链（EB贮液（10mg/mI.），称取1g化乙链，溶于1.00ml水中，用磁力硼热搅拌器搅拌数小时以确保其完全溶解，移至棕色瓶中，4℃冰箱中保存。KAONiKAca
GB/T 19564--2004
A,6.25×TBE称取54gTris于800mL水中，加人20mL0.5mol/LEDTA（pH8.0)和27.5g酸,定容至 1 000 mL,高压灭菌,贮存于室温。A.6.30.5×TBE.称取5×TBE100mL，期水定容至1000mL，备用。A, 7凝胶加样缓冲液
0.25%酚蓝,0.25%二甲萍膏FF、40%(质量浓度)蔗糖水溶液。A8反应体系中各反应成分的配制A 8. 11 U TqDNA 孵合薄
25L反应体系中需报人TagDNA豪合酬体积按公式（A.1)计算：Voo
式中，
V—TaqDNA 骤合酶的体积,单位为微升(μI.)D—TaqDNA案合酶的浓度,单位为单位每微升(U/μL).A.8.21.5mmol/LMg2+
25uL反应体系中蒂加入Mg*+体积按公（A2)计算：1, 5 X 25
式中：
VM+的体积,单位为微升<(μL);
D—Mg\+的浓度,单位为毫摩尔每升(mmol/L)。A, 8. 310 μmol/1, 引物
首先将引物离心，然后加水烯释。加永体积按公式（A，3）计算，放在一20℃冰箱中保存，每次使用前用水稀释三倍，终浓度即为 10 μmol/L。OD2 × 33
其中公式(A,3)中M的计算按公式(A.4)进行1M = nA X 313.22+nG× 329. 22+nCX 289.19+nT × 304. 19 -61. 97式中：
加水体积，单位为微升（L)
M—引物分子量,单位为克每塞升(/mL);ni--碱基数;
A——腺嗪(adenine)I
鸟嘌岭(guanine)：
C.胞嘧啶(cytosine)
T——胸腺嘧啶（thymine)。
藝考文献
GB/T19564—2004
[1］J.萨姆布裔克，E.F.弗里奇，T.蔓尼阿蒂斯.分子克隆，北京，科学出版社，1996[2] Benjamin Levwin. Genes .NewYark:Oxford UniversityPress,2000[3J Jain, A. , C. Apparanda, P. L., Bhalla. Evaluation of genetic diversity and genome finger-printing of Pandorea (Bignoniaceae) by RAPD and inter-SSR PCR. Genome 42, 1999. 714~71[4 Kujimn. T. , T. Nagaoka, K. Noda, et al. Genetic linkage map nf ISSR and RAPD markersin Einkorn wheat in relation to that of RFLP markers, Theor. Appl. Genct. 96, 1998.37~45[5] Lanham. P. G. , R, M. Brennan. Genetic characterizatian af gooseherry (Ribes grossulariasubgenus Grossularia) germplasm using RAPD, ISSR and AFLP markers. J Hort Sci Biotech 74,1999.361~366
[6] MeGregor. C. E. ,C. A, Lambert, M. M. Greyling, et al. A cotnparative assessment ofDNA fingerprinting techniques (RAPD, ISSR, AF1.P and SSR) in tetraploid potato (Solanum tuberosutn L,)germplasm. Euphytica 113, 2000. 135~144[?] Naganka, T. , Y. Ogihara. Applicability of inter-simple sequence repeat polymorphisms inwheat for use as DNA markers in comparison to RFL.P and RAPD markers. Theor Appi Genet 94,1997.597~602
E8J Willinas J G K et al. DNA polymorphism anplificarion by arbitrary primers are useful as genetic markers.Nucleic AcidsRes,,1990.18(4):6531-6535KANiKAca
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。