本标准规定了苏云金芽胞杆菌悬浮剂的要求、试验方法以及标志、标签、包装、贮运。本标准适用于由用于防治鳞翅目害虫的苏云金芽胞杆菌原粉和助剂制成的苏云金芽胞杆菌悬浮剂。 GB/T 19567.2-2004 苏云金芽胞杆菌悬浮剂 GB/T19567.2-2004 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS 65. 100. 10
中华人民共和国国家标准
GB/F 19567.2--2004
苏云金芽胞杆菌悬浮剂
Bacitlus thuringgiensis suspension concentrate2004-06-22发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2004-12-01实施
GB/T19567.2--2004
苏云金芽脑杆菌（Bacillusthuringiensis,B.t.)是日前应用最广泛的一种微生物杀虫剂，它的生要杀虫成分是作胞品体中的毒素蛋白，其中，本标准所检测的对鳞翅月害虫有毒力的毒素蛋白的相对分了罩为 130 k[a。生物测定中甜菜夜蛾用于检测对鳞翅且贪夜蛾属害虫有特性的苏云金芽胞杆菌慰浮剂的毒力，小菜蛾和棉铃虫用于检测对其他麟翅目害虫有活性的苏云金芽胞杆菌悬浮剂的毒力。本标准是根据我润以往制定的苏云金芽胞杆菌行业和企业标推等有关材料，结合我国的实际情况制定的
本标准对苏芸金芽胞杆菌悉浮剂的要求，试验方法、抽样以及包装、运输等作了具体要求和规定·从面为苏云金胞托菌生产提供了统一的技术依据。本标准的附录A是资料性阴录,附录B是规范性附录。本标滩由中华人民共和国农业部提出。本标起草单位：农业部农药检定所、华中农业大学徽生物农药国家工程研究中心，潮北省生物袋药工程研究中心。
本标摧主要起草人：姜辉，倒子牛，隧文、王梅，王晓牵、是新平，顾宝根本标痱山农业部农药检定所负责解释。1范围
苏云金芽胞杆菌悬浮剂
GB/T19567.2--2004
本标准规定了苏云金芽胞杆菌悬浮剂的要求、试验方法以及标志、标签、包装、贮运本标准适用丁此用于防淤鳞翅目害虫的苏云金芽胞托菌原粉和助剂制成的苏云金芽胞杆菌悬浮剂。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标推的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标推，然面，鼓励根据本标推达成协议的各方研究是否可饰用这些文件的最新版本。凡靠不注日期的引拥文，其最新版本适用王本标谁GB/T1250极限数值的表示方法和判定方法GB/T16002001农药水分测定方法GB/T 1601农药 pH值的测定方法GB/T1604商品表药验收规则
GR/T 1605一2001商品农药采样方法GB3796农药包装通则
GB/T16150—1995农药粉剂、可湿性粉剂细度测定方法GB/T5451-~2001农药可湿性粉剂润湿性测定方法3要求
3.1外观：棕黄色或褐色悬浮液体。3.2苏云金芽胞杆菌悬浮剂应符合表1要求。表1苏云金芽胞杆荫悬浮剂控制项目指标顿
毒素蛋白<130 kDa)/(%)
毒力效价(P... ,H.a. )/(IU/m1),(S. e.)/(H./mg)PH值
悬浮率(有效成分)/(为)
细度(150μm)/（%）
1. 5-~6. 5
注：P.T。，H.a.和S.e.分别为小菜晚（Piuiellaxyiastella）、棉铃虫（Heliothisannigem）和甜菜夜嫩（Spodoptera triguz)缩笃
4试验方法
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，所述溶液均为水溶液。4.1抽样
按照GB/T1605-2001中“液体制剂采样\进行，用随机数表法确定抽样的包装件，最终抽样不少于 250 mL.
GB/T 19567.2--2004
4. 2毒素蛋白含量
用十二烷湛硫酸钠-聚两烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶图像处理法进行测定。4.2.1方法提要
用碱性溶液处理办云金芽杆菌悬浮剂伴胞晶体，使其降解为毒索蛋白，然后避过SI)S-PAGE，侬蛋自质相对分子质量的差异，使毒素蛋自与其他杂蛋白分离，用电泳图像扫箍蛋自区带面积，进行定量。4.2.2仪器、设备
a）电泳仪；
b）双垂直式电泳（1.5mm凹形带槽橡胶模框），凝胶板面积170mm×170mm(1,5mm、20孔样品植模具）
电泳凝胶成像系统
d）离心机：10 00r/min:
e）分析天平：精确至0.0001g。4.2.3试剂和溶液
4.2.3.1过硫酸铵（APS)。
4.2.3.2二烷基硫酸钠（SDS
4.2.3.3四甲基乙二胺（TFMED)。4.2.3.4氢氧化钠。
4.2.3.5：30%闪烯酰胺凝胶母液，称取丙烯酰胺30.亚甲基双丙烯胺（原称：甲叉双丙烯酰胺）0.8g+溶于100mL蒸馅水中，过滤，于4℃暗处贮存备，4.2.3.6分离胶缓冲液：称取三羟基甲基氮基甲烷(Tris)18.17g和SDS0.4g游于蒸爆水中，用浓带酸调至pH8.8,用蒸馏水定容至100mL：4.2.3.7浓缩胶缓冲液：称取Ttis6.06g和SDS0.4g溶于蒸馏水中，用滋盐酸调至pH6.8用蒸馅水定容至 100 mL。
4.2.3.8电极缓冲液：称取Tris3.036g.甘氨酸14.42g，SDS1g，用水溶解并定容至1000mL。4.2.3.93×样品稀释液：1mol/T.pH6.8Tris-HC18.75mL.,SDS6g甘油30mL.毓基乙醇15mL.少诈溴酚蓝，用蒸馏水定容至100mL4.2.3.10固定液：过取95%乙醇500mL，冰乙酸160ml.用蒸馏水定容至1000mL4.2.3.11染色液：称取考马斯亮蓝（CBB)R-2501g，加入95%乙醇250ml..冰乙酸80ml，蒸馏水楚容至1000 mL,溶解过滤后使用。4.2.3.12脱色液：量取95%乙醇250mL，冰乙酸80mL，用蒸馅水定容至1000mL。4.2.3.13患素蛋白标样：毒素黄白（相对分子量为130kDa）含基为8.0%的原粉。4.2.4样品处理
将试样摇勾后取100μL加人-：1.5ml.离心管，加人0.5mol/L氢氧化钠溶孩25μL（使氢氧化钠浴液的终浓度为0.1mol/L）放置5min，称取标样20.0mg（准确到0.1mg），移至].5nL离心管中，加1mL水充分悬浮，取100μL如人另1.5mE离心管，加人0.5ma1/L氢氧化钠搭液25uL（使氢氧化钠溶液的整浓度为0.7tnol/1.），放暨约5min。分别向工述标样和试样中期入3×样品稀释液75μL，使最终体积为200pl.，于100℃沸水中煮沸6min，离心（2000T/min）10min后取上层清液，以备电泳上样。
4.2.5SDS-PAGE分离霉囊蛋白
4.2.5.1制备7.5%聚丙烯磁胺凝胶采用不连续缓冲系统，制胶方法见附录A（资料性附录)。4.2.5.2上样
取上述标样溶解液上层清被，于聚丙烯酰胺凝胶的上样孔中分别上样6、8，:0、12、14L（毒案蛋白GB/T19567.2—2004
含量约为3ug--71g），作为标准曲线，再取一定体积的试样溶液上层清液（薄案蛋白含量约为5μg）加人到上样孔中，注人电极缓冲液底，接通电源。4.2.5.3电泳
电泳初期电压控制在100V左右，待试样进入分离胶后，加大电压到170V，继续电泳，当指示剂前沿到达距底端1m左若时停止电泳，取出胶板，在7.5%（体积分数）之酸中浸范39min4.2.5.4染色
将分离胶部分瑕下，用考马斯亮蓝（CBB)R-250染色液染色过夜，4. 2. 5. 5脱色
倒去染色液，先用漂洗液洗涤凝胶，然后加人脱色液，于37℃恒温脱色，更换几次脱色液，至背景清晰为止。
4. 2. 6 浏定
胶板经脱色后，可清晰地看到分了量为130kDa蛋白区带，用凝胶成像系统对凝胶进行分析。样品中毒素蛋白的百分含量(X)按式(1)进行计算。XM
x×n×100%
M-~-由标准蛋白回归曲线计算得到的蛋白量；C样品的浓度；
V一一样品的加样体积;
\样品的稀释倍数。
4.2.7允许差
取其算术平均值为测定结果，两次平行测定结果相对偏差小于等于5%。4.3毒力效价的测定
按附录B(规范性附录)进行。
4.4pH 值的测定
按GB/T1601测定。
4.5细度的测定
按GB/T16150-~1995中2.2进行测定。4.6浮率测定
4. 6. 1仪器,试剂
量简:25() ml.,具塞;
b）吸液管：
e）秒表：
d）二角瓶：500mL100ml
恒温水浴锅；
标准硬水：配制方法按GB/T5451—200°中标准硬水配制方法进行。1
4.6.2操作步骤
将样品播匀后取5.00ml（精确到0.01mL），于100mL.=角瓶中，加入标准硬水100mL.用平左右振荡50次，制得的悬浮液移250mL.具塞量简巾，用标准硬水稀释到250ml将量简放人30℃.11℃恒溢水浴锅中，当悬浮液温度达到30℃时，将量简盖好，拿起或筒先轻轻摇沉淀物，然后有规律的以量微中部为中心上下额例304，使呈均匀的悬浮液，量筒仍放人恒温水浴中，打开盖子，静置30min用吸管以抽气法将量简上部9/10的悬浮液抽出（在15s～30s内完成）。抽液过程中，吸液管应依谢简壁随液面下降面下降，勿搅动下部沉淀。该供试悬浮剂及录筒内剩下的GB/T 19567.2—2004
25 mL悬浮液，按附录B（规范性附录)进行毒力效价的測定。4. 6.3 计算
样品中的悬浮率(Y)按式(2)进行计算：Y111.1x(C-Q)×100%
武中：
心一供试悬浮剂的毒力效价：
Q--一留在量简底部的25 tnI.悬浮液的毒力效价。4.6.4允许差
两次重复測定结果之差应不超过10%。5检验规则
符合GB/T1604有关规定。极限值按GB/T1250处理。6标志,标签、包装、贮运
6.1产品包装应符合GB3796规定，同时注明所用标准编号及检测所用试虫。6.2悬浮剂主要采用塑料瓶包装，密封。6. 3贮存时严防H晒，勿受压，置于阴凉干燥处。6.4运输时,注意轻放，防止损坏。2
6.5保证期,在正常贮运象件下，苏云念芽胞杆菌悬浮剂质量保证期从生产日期算趋为十八个月，产品出厂时毒力效价秘毒素蛋自的含量小低于3.2指标，保质期内产品毒力效价和毒素蛋妞的含量不低于3.2指标的60%。
A.1制板
附录A
(资料性附录)
电泳凝胶的制备
GB/T 19567.2--2004
本实验选用双垂直电泳槽，具体操作根据实验室条件而定。基本操作是根据电泳槽商矮大小，选择两块大小一样的蔽璃板，其中.块端部带有2心们！～3心m高的凹槽。两块陂璃板洗净于燥后，在无凹槽的玻璃板两边各放·条“间源条”（塑料条、胶条都可以，其宽度、厚度根据需要面定），然后放上带凹槽的玻璃板，用夹子将两块玻璃板固定，这样两块玻璃板之问就形成了定的间隙。形成的间隙下端应该封闭，以防灌人的胶液漏出，一般用胶纸条封闭，待灌入的胶避固后，再撕去胶纸；或用1%～1.5%浓度的琼脂封闭，方法是：在琼脂中册人电极缓冲液或蒸馏水，在沸水浴中热溶解，将带有彻隙的玻璃板装置垂直放在一个高3cm、宽3ctn、比玻璃板宽而长的一个小槽内（商品电泳槽有配套装置），趋热将溶解的琼脂胶灌人小槽内，待冷却后取出，玻璃板装置下端即封严，可进行灌注聚内烯酰胺胶液。A.2制备分离胶
从冰销中取出制胶试剂，平衡至案温，按表A.1配方配制分离胶。本试验中分离胶浓度为7.5%。按表A.1配方将胶液醒好、混匀后、迟速注人两块剪璃的间隙中，至胶液面离玻璃板凹槽 3m左右。然后在胶间上轻轻铺m高的蒸馏水，加蒸缩水时通常沿坡璃板慢慢加人，勿扰乱胶面。垂直放置胶板于室温，1h左右使之凝聚。此时在凝胶和蒸水之可以看到很清晰的一条界面。然后倒掉胶面小的蒸馏水，
A.3制备浓缩胶
用最根据实际情况而定，制备方法按表A,1配方配谢。按表A.1配方将胶液混会，取少量灌人玻离板间中，冲洗分离凝胶面.而后倒出。将余下的胶液注人玻璃板间间，使胶液液面与玻璃板凹槽处平齐，而后插人“梳子”（样品槽模板），在蜜温放置20min~30min，浓缩胶即可凝聚。凝固后，慢慢取出“梳了”，取时应防把胶孔齐被，取出“梳子\后在形成的胶孔中加人蒸馏水，冲洗未凝聚的内烯酰胺等，倒出孔中蒸馏水，再邮入电极缓冲液。将灌好胶的玻璃板垂直固定在电泳槽上，带凹的玻璃板与电泳紧贴在：·起，形成一个贮液槽，向其中加人电极缓冲液，使其与胶孔中的缓冲液相接触，在电泳槽下端的贮液槽中也加人电极缓冲液表A,1SDS-PAGE凝胶的配方
贮存液
30%丙烯酰胺母液
分离胶缓冲液
浓缩胶缓冲获
双蒸水
10%过硫酸胺(APS)
四甲基乙二胺(TFMEE)
分离胶
浓缩胶
GB/T 19567.2---2004
（规范性雕录）
毒力效价的测定Www.bzxZ.net
B.1薄力效价的測定方法-用小菜(Ptutetla xytostelta)作试虫的测定方法B. 1.1试剂或材料
标推品：CS-1995，Hab，20000IU/mg。小菜峨幼虫：Pluteliazytostella食用菜籽油。
酵母粉:工业用。
维生素 C:医用,分析纯。
琼脂：凝胶强度大于300g/cm。
磷酸氢二钾：分析纯。
磷酸二氢钾：分析纯，
聚山梨酯-80：粘度3.5×10m/s~5.5×10m/s菜叶粉：日蓝型油菜叶，80℃烘干，磨碎，过80目筛。糖：分析纯。
纤维素粉 CF-11,
氢氧化钾：分析纯。
氮化钠：分析纯
15%尼泊金：对羟基苯甲酸甲酯（化学纯）于95§酒精。10%甲醛溶液：甲醛分析纯)溶于蒸馅水，T酪素溶液;于酪素(FR 生物试剂)2 g,加 U, U01 mol/L. 氢氧化钾 2 mL,8 mL 蒸馏水,灭菌。磷酸缓冲被:氯化钠 8. 5 名,磷酸氢二钾 6, 0 ,磷酸一氢钾 3. 0 宫,桑山梨酯-80 溶液 0. 1 mL,蒸缩水1 000 ml..
B.1.2仪器、设备
磨T三角瓶;250 mL,具塞。
分析天平：精确到0.1g。
电动搅拌器;无级调速，l00 t/min~6 000 r/min。医用手术汀。
微波炉或电炉，
药器。
水浴锅。
养虫管:9 cmx2. 5 cm.
小烧杯：50mL，
大烧杯：500mL。
试管：18mm×180mml
玻璃珠;直径 5 mm。
移被管;1o mL,5 mL,2 mL,l ml
B. 1. 3 测定步骤
B. 1.3. 1感染液的配制
B, 1, 3. 1. 标准品
GB/T 19567.2—2004
用分析天乎准确称取标准品100.0mg~15c.0mg（精确到0.1mg）放入250mL装有10粒玻璃珠的磨且三角瓶中。加人 100 ml, 磷酸缓冲液,没泡 10 min,在娠药器.f:振荡 3 nin,得到浓度为1mg/mL的标准品母液（该母液在4亡冰箱中可存放10天）。然后将标准品母液稀释成浓度为1.000、0.500.0.250、0.125、0.0625、0.0313mg/mL六个稀释感染液B.1.3.1.2悬浮剂样品
将样品振荡20 min,充分摇。用移液管吸取样品10.00 mL(精确到0.01 mL).加人装有90 mL无菌蒸馏水的磨1.1三角瓶中，吸洗兰次，充分摇匀得到100μL/m1的母被。将母被稀释减含量分别为4.000,2.000、1.000,0.500.0.250 利10. 125 μL/ mL六个梯度稀释液对有些效价过高或过低的样品，在测定前需先以3个距离相差较大的浓度做预备试验，估计致死中浓度(1值)的范围，据此设计稀释浓度。B.1.3.2感染饲料的配制
饲料配方：维生素C0.5g，干酪素溶液10ml，菜叶粉3.0g，醉母粉1.5g.纤维素粉1.0g，琼脂粉2.0g，燕糖6.0g，菜籽油0.2mL，10%甲醛溶液0.3mL.15%尼泊金1.Gml，蒸窗水100mL.游蔗瓣、酵母粉、干酪素溶液、琼脂粉加人90㎡I.的蒸馏水中调匀，搅拌煮沸，使琼脂完全溶化，加入尼泊金搅勾，将其他战分用剩余的10mL蒸水调成糊状。当琼脂拎却至75左右时与之充分混合，搅句，置55℃水浴锯巾保温备用。取50 ml.烧杯7只，写好标签，置55C水中预热，分别向每个烧杯中加人1mI对应浓度的感染液，以缓冲液作空白对照。而每个烧杯中加人9mL溶化的感染何料，用电动搅拌器搅拌29$,使每个烧杯巾的感染液与饲料充分混匀。将烧杯静置，待冷却凝固后，用医用手术刀将感染饲料切成1ti×1c 的饲料块。每个浓度取4个缅料块分别放人4支养虫管中，每餐放入一块，写好标签。B.1.3.3接虫感染
随机取已放置饲料的养虫管。每管投入10头小菜蛾一龄初幼虫，每浓度4管，塞上棉寒，写好标签，在相同饲养条件下饲养。
B,1、4结果检查及计算
感染48h后检查试虫的死亡情况。判断死虫的标准是以细签轻轻触动虫体，无任何反应者判为死亡。
计算标准品和样品各浓度的供试昆虫死广率，查Alil01l表或计算校正死亡率（Xt）。空白对照死亡率10%以下需要校正，大于10则试验结果无效。校正死亡率按武(B.1)计算：
式中+
T—药剂处理死亡率；
C空白对燕死亡率。
只x100%
将感染液各浓度换算成对数值，校正死广率转换成死广儿率值·用最小二乘法分别求出标谁品C值和待测样品LC值，计算待测样品的毒力效价X）。每力效价按式（R.2)计算：
S.--标推品 ICs-值;
P—标准品效价：
GB/T 19567.2—2004
Y样品LC值。
B, ±. 5 允许差
毒力测定法允许相对偏差，但每·个样品3次重复测定结果最大相对偏差不得超过20%。毒力测定制剂各浓度所引起的死亡率应在10%～90%之间，在50%死亡率上下至少各有两个浓度。B,2毒力效价测定方法——以棉铃虫(Heliothis armigera）作试虫的测定方法B.2.1试剂和材料
标准品：CS-1995.Hb+200001U/mg。棉铃虫幼虫：Heliothisarmigera。黄豆粉：黄豆炒熟后磨碎过60目筛。大粉：过60目筛。
酵母粉:工业用。
36%乙酸液：乙酸（化学纯）,溶于蒸馏水。苯甲酸钠：分析纯。
甲醛：分析纯。
维生素 C:医用,分析纯。
琼脂粉：凝胶强度大于300g/cm2。磷酸缓冲液:同 3. 1. 1。
E.2.2仪器.设备
分析天平：精确到0.1ng。
电动搅拌器：无级调速，100 r/min~-000 r/min微波炉或电炉，
振荔器。
水裕锅。
组织培养盘：24孢，
塘瓷盘：30 cm×20cm。
磨凹三角瓶:250 tnml.,具塞。
大烧杯:1 000 ml。
小烧杯：50m。
试管：18mm×180mm
玻璃珠;直径 5 mm.
注射器,50 mL。
标本缸
恒温培养箱。
B.2. 3测定步骤
B,2.3.1简料准备
饲料配方:酵母粉 12 g,黄豆粉 24 g,维生素 C 1. 5 g,苯甲酸钠 0. 42 g,36%乙酸 3. 9 ml.. 蒸缩水300 mL。
将黄草粉、酵母粉、维生素 、苯甲酸钠和 36%乙酸放入大烧杯内，加 100 ml,蒸馏水显润备用：将余下200ml.蒸馏水加人琼脂粉内，在微波炉上加热至沸腾，使琼脂完全溶化，取出羚却至70，与其他成分混合，在电动揽拌器内高逆搅拌1min，迅速移至60水浴锅中加益保温。B.2. 3.2感染液的配制
将悬浮剂样品充分振均勾后，吸取 1.00 mL(精确到0.01 mL),至盛有玻璃珠的磨口具塞三角瓶GB/T 19567.2--2004
中,加磷酸缓冲液 99.0 mL,浸泡 10 min，在振荡器上裳荡 1 min，即成母液。于分析天平:称取150,0 mg～~300.0 mg标准品（精确到0.1nig）,如上法制成母被。将样品和标推品母液用磷酸缓冲液以一定的借数等比稀释，每个样品和标推品至少各稀释5个浓度，并设缓冲裤作对照，每一浓度感染辫吸取 3 mL 至 50 mL 小烧杯内待用。对照吸取 3 mL磷酸缓冲液。B. 2. 3. 3饲料和感染液的混合及分装用注射器吸取27饲料，进人工述巴有样品或标推品感染液的烧内，以电动搅拌器高速搅择0.5 min,逆速人组织培养盘上各小孔中(倒入量不要求一致，以铺满孔底为推)。凝固待用。B.2.3.4接虫感架
于26℃:~30C室温下,将末经取食的初孵幼热(孵化后 12 h内)抖入直径20 cm的标本缸中，静待数分钟，选取肥上缸山的健康幼虫作供试虫，用毛笔轻轻地将它们移人已有感染饲料的组织盘的小拒内，每孔一头虫。每个浓度和空白对照貨故48头虫，用塑料薄片盖住，然后将组织培养盘遂个叠起，用橡皮筋捆紧，竖立效于30℃恒温培养箱内培养72h，移.2、.4结果检查和统计分析
用肉眼或效大镜检查死，活虫数。以细签触动虫体，完全无反应的为死虫，算死亡率。如对照有死亡，可查Abhtt校正值表或接式（B.1)计算校正死亡率。对照死亡率在6%以下不用校正，6%~15%之间需校正，大于15%则试验无效。将浓度换算战对数值，死亡率或校正死亡率换算成儿率值，用最小二乘法分别求出标推品和样品的LC5值，按式(R.2)计算毒力效价。B.2.5充许差
毒力测定方法的充许相对偏差要求与B.1,5 相同，B.3毒力效价测定方法—以甜莱夜(Spodoprera xigua）作试虫的测定方法B.3.1材料和试剂
标准品：CS-2002.Ib，20000IU/mg甜菜夜蛾幼虫，Spodopterutrigua，黄豆粉：黄豆炒熟斥磨碎过60目藓。酵母粉(200 目):工业用。
维生素 C:医用,分析纯，
15%尼泊金：对羟基苯甲酸甲酯(化学纯)溶丁95%酒精。10%甲醛：甲醛（分析纯)溶于蒸馏水。琼：凝胶强度大手300/cm。
蒸耀水。
B.3.2仪器
分析天乎，精确度0.1mg
电动搅拌器：无级调速，100r/min-~6000r/min微波炉电炉。
振荡器。
水浴锅。
组织培养盘：24孔：
携瓷盘：30cm×20cmz
磨口三角瓶,250 ml,具寒。
大烧杯：1000mL。
小烧杯：50ml.
试管：18mm×180mm
GB/T19567.2-2004
玻璃珠：直径5tm.
注射器:50 mL。
标本衍。
恒漩培养箱。
B. 3. 3 测定步骤
B. 3. 3. 1衡料配方
黄豆粉32g（60日），酵母粉16g（200目），琼脂6g，维生素C2g+15%尼泊金6.7mL，10%甲醛4 mL,水400 mLa
将黄豆粉、酵母粉、维生素C、尼泊金和10%甲醛效入大烧杯中，加入150mL水，混勾备用。将余下的2501ml.水加人琼脂，在微波炉上加热至沸腾，使琼脂完全溶化，取出冷却至70℃。与其他成分混合，在电动揽拌器内高速搅拌1min，迅速移至60%水浴锅中加盖保温。B.3.3.2感染液的配制
称取（Szab-2002标准品150.0ng~300.0mg精确到0.1mg）、至盛有玻璃珠的磨口具塞三角瓶中，加入100ml.磷酸缓冲液，没泡10min，在摄荡器上振离1min后即成标准品母液。将惑浮剂样品充分振荡均匀后，吸取1.00mL（精确到0.01mL），至盛有玻璃珠的磨口具塞三角瓶中，加磷酸缓冲被99.00mL，没泡10min，在振满器上振1min，即成样品母液。以两倍稀释法将母液稀释成一定浓度梯度，每个样品至少各稀释5个浓度梯度.每一个浓度感染液吸取3切L至50mE小烧杯内待用。对照吸取 3 mL磷酸缓冲液。
B.3.3.3饲料和感染液的混合及分装用注射器吸取27加l.饲料，注人上述已有样品或标准品感染液的烧杯内，以电动搅拌器搅拌0.5min，迅速倒入组织培养盘上各小孔中（倒人量不要求一致，以铺满孔底为推），凝固待用，B.3.3.4接虫感染
于26℃～30℃室下，将未经取食的初孵幼虫（孵化后12h内）抖人直径30cm的标本缸中，静待数分钟选取肥上缸口的健康幼虫作供试虫·用毛笔轻轻地将它们移人已有感染饲料的组织盘的小孔内，每孔头虫。每个浓度和空白对照背效48头虫，用塑料薄片盖住，然后将组织培养盘逐个叠起，用橡皮筋捆紧，竖放于25℃培养箱内培养72h。B,3.4结果检查和统计分析
用肉眼或放大镜检查死、活虫数，以细签触动体，完全无反应的为死虫，计算死亡率。如对照有死T.，可查Abbott校正值表或按式(B,1)计算校正死亡率。对照死亡率在6%以下不用校正，6%～15%之问箱校正，大于15%则试验无效。将浓度换算成对数值，死已率或校正死亡率换算成几率值，用最小乘法或有统计功能的计算器，分别求出标准品和样品的1.L·按式（B.2)计算毒力效价。B.3.5允许差
毒力测定方法的允许相对偏差要求与B1.5相尚，B.4对接入其他有效成分的可疑样品的检测对于某些符合正文3.2分析指标的可疑样品，可通过测定悬浮剂中服晶混合物的毒力贡献率，翔定样品是否捧人其他有效战分，B,4.1悬浮剂中不同成分的分离
用内将最浮剂释释成10mg/1nL的浴液.4℃下5000r/min离心10min，保留沉凝组分，用等体积的内酮悬浮，再进行离心，共离心洗涤3次，保留沉淀组分；用等体积的蒸馏水悬浮沉淀组分，离心并保留沉凝组分，共离心洗涤3次，保留沉淀组分，该沉淀组分即为悬浮剂中的胞晶混合物。B.4.2毒力效价的测定
按R.1、13.2或B.3的方法，对悬浮剂及悬浮剂的沉淀组分（胞晶混合物)分别进行再力效价测定。
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