ICS 11.020 C 62 WS 中华人民共和国卫生行业标准 WS/T 571—2017 裂头蚴虫幼虫检测 Detection of diphyllobothroid larvae 2017-08-01 发布 2018-02-01 实施 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 发布 前言 本标准依据GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准起草单位：中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所、上海出入境检验检疫局、上海市疾病预防控制中心。 本标准起草人：陈韶红、李树清、张小萍、许学年、卢艳、蔡玉春、张永年、李浩、艾琳、郑彬。 1 范围 本标准规定了裂头蚴虫幼虫检测的操作流程。 本标准适用于各级疾病预防控制机构、医疗机构和食品检测机构对鱼、蛙和蛇中裂头蚴虫幼虫的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 18088 出入境动物检疫采样标准 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 裂头蚴（plerocercoid larvae） 裂头绦虫的幼虫，是假叶目（Pseudophyllidea）、裂头科（Diphyllobothriidae）绦虫第三期幼虫的总称（参见附录A）。 3.2 阔节裂头蚴（plerocercoid larvae of Dibothriocephalus latus 或 Diphyllobothrium latum） 寄生在鱼体内阔节裂头绦虫的第三期幼虫。 3.3 曼氏裂头蚴（plerocercoid larvae of Spirometra mansoni） 寄生在蛙、蛇或人体内曼氏迭宫绦虫的第三期幼虫。 4 仪器器材 4.1 生物显微镜 4.2 体视显微镜 4.3 PCR扩增仪 4.4 电泳仪 4.5 凝胶成像系统 4.6 超净工作台 4.7 高速离心机 4.8 解剖用手术器械 5 试剂材料 5.1 试剂 胃蛋白酶消化液；Tris-乙酸电泳缓冲液（TAE）；琼脂糖凝胶；6×加样缓冲液；100～2000 bp DNA marker；灭菌双蒸馏水（ddH2O）；70%乙醇。 5.2 引物 扩增裂头蚴核糖体DNA转录间隔区（ITS）引物序列；扩增裂头蚴细胞色素C氧化酶（Cox1）引物序列；阔节裂头特异性引物序列及曼氏裂头特异性引物序列。 5.3 阳性对照 裂头蚴相应基因片段的阳性克隆质粒或裂头蚴、裂头绦虫全基因组DNA。 6 检测步骤 6.1 样品准备 6.1.1 样品种类：海鱼、淡水鱼、蛙和蛇。 6.1.2 样品采集：按照GB/T 18088执行。 6.2 样品检测 6.2.1 压片检查法 对受检鱼、蛙和蛇逐条/只解剖，取出内脏，刮取腹腔壁内膜，观察腹腔表面。 如发现白色点状可疑物，用手术器械分离肌肉组织，取含白色点状物组织制片，在显微镜下检查并判定结果。 6.2.2 蛋白酶消化法 称取样品250 g，剪成小块，按1:5比例加入胃蛋白酶消化液，在37℃消化至无肉眼可见组织。 消化后用网筛过滤，滤液置尖底量筒，加水至刻度，沉淀洗涤至澄清。 将沉渣置平皿中，用体视显微镜检查并判定结果。 6.2.3 核酸检测法 6.2.3.1 取样 在体视显微镜下挑取虫体进行初步鉴定备用。 设置阳性对照和空白对照（无菌水）。 6.2.3.2 DNA提取（见附录B） 6.2.3.3 PCR反应体系（25 μL） 模板DNA 2 μL，上下游引物各0.5 μL，dNTPs 2 μL，MgCl2 2.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，Taq酶0.2 μL，加ddH2O至25 μL。 6.2.3.4 PCR反应程序 94℃预变性3 min； 94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环； 72℃延伸7 min。 6.2.3.5 电泳检测 取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下观察结果。 6.3 结果判定 （此部分原文未完整提供）