本标准规定了谷物及其制品(蛋糕、饼干、面包等)中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON、呕吐毒素)的薄层色谱测定方法及免疫测定方法(EIISA)。本标准适用于谷物(小米、玉米、大麦等)及其制品(蛋糕、饼干、面包等)中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON、呕吐毒素)的测定。本标准第一法检出限0.1mg/kg，第二法检出限为0.1ng/kg。 GB/T 5009.111-2003 谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定 GB/T5009.111-2003 标准下载解压密码：www.bzxz.net

1CS67.040
中华人民共和国国家标准
8/T 5009.111—2003
代誉GB/T14929.5199
谷物及其制品中脱氧雪腐镶刀菌烯醇的测定
Determlatio of deoxynlvalenol In cerealand cerealproducts
2003-08-11发布
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
2004-01-01实施
GB/T 5009.111-2003
本标准代荐GB/T14929.5
51994谷物及其制品中股氧古痴疆刀函烯醇的测定力法多。本标准与(B/T14929.5—1\94相比=要修改如下：修改了标准的中文名称，标准中文名称收为《容物及其制品中脱氧雪离操儿的烯酶的测定按G，T20011.1一2001标准编孕规则第4帮分：化学分析方法对原板准的结构进行厂惨改.
本标准出中华人民共和国以牛部提并口，牛标准起草单位：卫生部食品卫生监督检验所。全标准第一法主要起草人，魏润产标惟第二法主要起草人阳传和、史驾云，计融，原标准于1954年首次发布，本大为第饮快订，
GB5009.111-2003
容物及基制晶中脱氧雪腐镶刀菌烯醇的测庭本标推规定了容物及其品蛋熊，讲干面包等宁说掌平度课菌烯醇，呕提款）的薄色泄谢定方法及免凝测方法EIISA。本标溢于等数（小米，下米，大变等）及其测品<量梯，饼于，血包等）中说氧写感罐刀也烯酵(，）的、
本标准第一德验出限，：/kg第.二凌检出限为0，.p/。第一法薄层售谱测定法
？原理
谷制及其制品中的股料书质爆离烯醇经提取、净化，浓利硅胶6薄层展出后，如热海炭能：所于在剂备薄层版时人了二领化销、使税象售底渠儿带然在聚外光灯下能益色或光，与标量多轻。
3拭剂
3.1 餐甲烷。
3.2无永己醇，
3.3甲每
3.62满、
3.7丙露：
3.8并丙醇。
3,10无永乙。
3.载化铝（（·GF：化学纯
3.12中性氢化频核用、经300心危化45十燥器中寄用3.13活性炭：20后性发，用mo1/.然落满视泡过夜，抽满后，成热热增水说荧氯离子，症120元烘羊备。
3.4截校G据层层析用。此内容来自标准下载网
3.15说氧离腐赚刀菌烯醇（以下简称DON)标痛将液，精率称取、5.0gLX.加乙酸2.路臣醒3！溶转塑此游
吸敢北标准游液5a.月乙酸乙器-甲醇（9+1帮释室1个n1.此落液带亮含比g：校器
4.1小塑粉摔机，
4.2电动振萄器。
4.3m.或黑发，
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4.4层析在：内径2zm1,长1c cm.不具活案，4. 510 mL 其塞浓缩痴:病部,H C. 2 mL 刻度另管,4.6坡喇板.5cm×2ucm
4.7薄层亲布器n.5smm.
4.8展元借：内长25cm宽6en,商4cn.。4.9紫外光灯：365nm.
4.10誉量注射器,10 L,5J mL
EOml.平房学，
4.12双被长薄层扫描促荐数退处垂机。5分析步瞬
5. 1提取
称取20g粉许试样置于230mL其寒瓶中3ml.水和10ml三氯甲烷-无水之醇k十2密，在板密上展水，益盖严前漏，活荡1k过折叠快压定性弹纸过滤收25mL滤液于75mL胶班蒸发血中，置90水带上通风乘干.
5.2净化
5.2.1液-夜分配
5.2.1.1谷物：用50mL石油分次浓解蒸发而中的惑造，说人100mL分液游斗中4用2Cml（E米试烊用心mL)甲醇-水(4一1)分次浣涤热发血，转人司分液需斗中5.2.1.2谷物制品（蛋格、饼下、面位等），用100=l.石油醚分次溶解蒸发中的残查，洗人250口lL分策满平中，料月中萨-水（一1)外次嵌蒸发,转人司一分藏耐中。搬掘分获痛车1.5m1n，静含约15m:n使分层后，将下层中醇术括收落过注净化个要将两相交界处的户色款状物放人柱内：
5.2.2柱净化
5.2.2.F小表及其制品：在层所片下销与小管逆结处塞约0.1g脱脂棉.尽录赛繁，光装人0.5性签化结，平表面.再加0.4活性然，紧。特层新柱下端小肾插人一核皮塞，塞在推滤瓶上，轴游瓶中放一平底管接竞过柱就将抽滤瓶接上水系或真空系，销稍开启泵，使活性炭压载将分满漏斗中的和醇-水提取液小心均活管壁加入柱内，控制流速为每11~1%满～2)满(3mlia)，甲醇-水提取过柱快完些时,人10L甲醇-水(4+1)淋沈，抽滤，至柱内不再有体流出。过性速度控制在2ml./min~3m1./min.速遇太伙净化教果不娅，太慢耗时.k长，5.2.2.2天本，同5.2.2.1只是将活性炭的用缺改为0.3g5.3制备尊屋屋析用样酒
将过柱后的洗脱液倒入75mL玻璃蒸发Ⅲ中，用少地甲醇-水<1十1)洗涨平展皆，将热发僵置水浴上报蒲率干
5.3.1小友趋热加人31nL乙酸乙酯，加热至，在水浴锅上轻轻地反友转动热发压数次，使充分沸胖将渣中的V籍出，井涛乙酸乙配择发至T，再加人3al.乙最乙酯同样处理一次，物辫剂痒干：最后3mL乙酸乙酯-加热至沸，效冷至座温后转人瞻瓶中，仍用三份1.5mL乙酸乙洗蒸发血，并人浓箱版中，
5.3.2小变制品，主*：整热加人3mL乙酸乙酯，加热至沸，在水溶弱上轻轻地反盘转动热发正数次：快充分沸胖将残造中TDCN溶山，放冷至室祖后转人浓编瓶中。约.5rm1.甲醇-内酮（十2)于蒸发血中，用玻树动碎解戒整、将蒸发！罩水塔蜗上挥十萨剂后，加人3㎡I.乙酸乙随，加热至沸，转动然发血使充分佛脏，放玲至室据后转人同浓缩激中，再0.5mL日等内配（112)和3mLZ.晚菌同样处理一次，乙酸乙陷提取策人法能巾。54
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将浓缩准食约95C水裕上用充加热咚气浓缩至干，放冷至案温后加人，2血L三益甲烷乙抛（型十)游解藏造留作薄层尝析用。5.调定
5.4.1薄总版的制备：硅股G约S1光氛化铝（Al：6H：0)水溶滋，正约2mn案粘翻状，销成5×20cm的薄层一块，置室谨十燥后，于105%活化1h，十燥器中备用，5.率.2点样：在每快涨层短..所下2.5cm能获线上点样，第-快板，对年-个试样先点第-·块薄层板。在左近缘.8n处点T.样滚，在需板上端1.5m处的横线土关与基短京详点相对应的位量上点2TION标液（n2）。按5.1.3.】条下偿展率层惊，择干搭热后再在层板上距发动缘1cm处的基线上点2LDCN标准满5g）。第二块板：在第一快税上米品荧光的成样则需准第二映降层板上距左边然6.多Cm三处满加25禅激加1标准液），在距过2m处滴灿1标准液25）准距右边整，处满切2！称准液。对和些成样进行摄珞定量：在薄板距至达缘08c~1c处滴加机装点（退感情况站计商证黄，或通择示定），在起板左边袭2Cm率科在护有边1.2拍处分别满阀二个标准点：小的盘可步50g，75ng10》g，再在期板上端1.5cm处的横线上点兰DC标难点（名约5R)他之与基线七的三个点相对应。5.4.3展升
横展剂：乙醛、乙醛-率（S5十5)或泛水乙性。选其中一种，使试举1D0>点偏离原点0.7ctl--1cm·削与杂质荧光分并，
展削二甲烷两的-导丙醇(8十1十1>三氟甲烷-丙醇-异丙醇-水（7.：十1+1.i一0.1)。5.4.3.1满总我接带内衛人10 mL横剂。将点好样的薄启板非栏腋点的长边舒没人弃划.展牟被请过minzmin取出风拍min对小安制品还须mL不醛3~l描展-欢，1min出通风择min
5.4.3.2效展：资房开槽内例人10m1.织度报、将横展率工尼的薄层板骨展开怕内领费159，取出通疯搅下1！.由于柔法分降的效果受空气湿彩钢大，当板分离教果不时第一快薄层越的试祥点对近有亲适竞非干扰时，可按极性人小依改臣以下几种展开方武。s）三氯甲烷丙期丙醇【8+1十1）1）三氟甲烧-两酮两醇（1十1)并在股五增盘内面防水饱相的滋纸c)浆果焕-降酮异两醇-水7.5+1 2. = +(.1)。）一甲烷内酮异闪醇水(7,5111.5.在展开裙内面水施和的泄纤。收换纵展方我，尺开落二块薄层板。如低开树内版性太大，会快闪点谱，5.4.4显荒北：先视衰术加热的薄层板可见到是蓝紫爽光的下就点这时TX不显获光，热薄层报后，杂原点仍是烫光，它在D荧光点除近，但不十忧XN，就后将此薄晨版139C烘辨中热m--0疯出放在冷的表-后m荣外现禁5.4,5观禁与评定，薄层恢经横嵌质,板L详随款的IXN移动的(.7m~1正是报据这一点在拟展所使试样ON点偿说了亲质荧光的抗。游层板上端木些数展的三个FOY标准点可分别作为质展试样KN点和一个标准X点的横向定位点，试排N点及与数展后的N标非点比较K：范商定件这样双横向和级向期个方图确定试样1XN点满位骨，认判定性的日的。一个标随点的悦留上的无杂质炎干选。
如在第一块薄层板上样液显落光，而在第块满层按上.得较一25%标准所壶激光强资可25标推相等试祥中含为房生或.05g以下，非战略定量时理然牌限板上一个1X点我销展宁都俏有帮动，何对膏点费老骚度无影响，两子标选点可距于试样II点比较黄光强型
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5.4.6光率度计测定：激发光歧340nm、发射冶波K400nm，在薄层板上标准10小荧光点至少在120g200g.490g时，得的应与D0V的量大呈战性关系，对DC告量在1.3mgkg以上的试样才出光率意则定。当DN含量在0.mg/k时点nl.样波使测得的DON量落在130--200g之间。用薄层光密惠计测定时每块板上滴二个陈准[KN点.N标准点的量为_00：200ng或20Crg-150ng，以测得的单面假值为纵坐核，1)CN的展为横坐称，绘制标准此线5.4.7结果计算
校式（1)计算：
式中：
试群中D(>N的含量，单位为寇克每T克（m/kg）A
薄点板上测得饿点上)V的量，单位为微克（：加人一氧甲榜-乙晴绳合策熔解或流的体积，单为毫升（L）：滴面举綫的体积，羊位为寇力（ml.)，我的总积释信数！
三素年烷-乙睛混合液溶解残盗相当试样的质量，单位为史（g）。--( 1 )
5.4.日标窖宽：当室凹小麦中加人DON量为n.3,0.5、1ug/kg，每个水平n=4时，日视比较测定钻具别为c.2378±G,323k.0.5=0,681g、0.(97gU.112g：用满层光密[计洲定站果分别为0.290g13.05.0.450.0771=0,15g小制品的0N回收80~10056，空白米中人(N量为0.3.0，：,1mg/%，每个水半=4时日视比较测定结果为C.234+5.05g、0.415.0，G.OO=n，以上数据为X-SD，
第二法免晓测定法（ELISA）
6原理
将已知抗原吸在固柑截体表面、洗除木吸附抗原：加人一定量抗体与持搬试择（含有抗原）提收液的限合液，竞争祖旁启，在固相载体表固形成抗凉抗位复合物。诺除来余抗体成分，然后加入酶标记的抗免球蛋凹的第轨体站合物，与吸附在体：面的抗原抗复合物结合，妇人韵证物，在慎的谢化作用下，底物发生降解良应，产生有负产物，迪过醛标检测仪，测出配试物的降解量，根据标准曲类计算设测试详中的抗原量。
7试剂
7.1抗拌，杂交烟细胞系3？产生的抗收吐事常的特异性单克降抗体7.2抗原呕业币索与载体蛋白-牛血清白蛋自BSA)的结合物（LKOV-BSA)7.3牛血清白蛋白（RSA），四甲基联率胶：免抗鼠免烧球蛋白与辣根过氨化的的结合物7.4温20，3过化氢H0，甲醇，瓶烷石油醛，无水之，之酸.中作化钥知性炭.
所有其他化学药品，均为分析纯试剂，求为药幅水或同等纯变的本，7.5他被绥冲液为1H9.的碳酸盐规冲减，配制方法为称取1.50R端能销(NuO,),2.S3g碳磁氢O加1ml
7.6洗条液为含.15%吐盘-20的H7.4均碳盐滋冲滚（简殊PHST)。配剑方法为：
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称取磷酸氯(KHF()>0.2号磷酿驾兰钠(NaHPO,.12HO)2.点化钠NaC)3.0R.熟化钾(KC1>0. ,:湖-25 . 5 mL,水至 [FC .,7.7房物经冲减为pH5.0的磷酸-柠登酸级冲镀·配制方性为.,moi/L柠禁酸(CH,0,H.O).即称做柠蒙水1为甲游：
3.2mo1/1.磷酸氢=销NgTIT(),）格取磷酿点二的284g加水至1300为乙减：取甲液24.3mL.7.夜25.7ml切水率100mL，即可。7，日区吐毒素标准滴液
用中前成，%/m.呕吐毒案资戒，“-80冰糖贴存。于检薄当天，精来股取端液，用2%醇的PRS(配方法1S-1本精2C即)保释或制各标谁曲绣的所需装度电纹器
所旧垂痴器血均时斑酸选凝没池：用自来水洗，蒸癌水冲流。8.1
醇标检漫仪：
6.2酶标敲孔板（4孔或始孔
3电动泵诺器
8.4电热恒润水浴梯：
8, E具 0. 2 ml. 房管的1 ml-小张著滋h25tm1.分滑斗。
9分析步
91望取
称20碎井通效20日路的优样，写20民室三单烧，加8水和100一平统无水乙醇（4+1）.在瓶塞上抹一层水益产防满，娠落1h后，通过恢球定性滤纸过诺，收25m1.滤液了蒸发门中，90水裕上通风挥于。币6石油醚分次游解需发中或造，入250分滤漏斗中，再用20ml,甲谢-水（一1)分次洗染转入同一分摘漏斗巾，派诺1,5min，收下层甲醇水提取疫过尽析柱净化<层析托的装备，在尽析下端予小曾相连接处窄人约心1乌脱朋棉，尽量塞紧，先装入0.5g中性氧化辑-原平装面，再人3,4活性涉，敲袭）。长注后的洗脱随创入燕发温中，将馨发乱置于水淤钢5浓缩军干，愁热加3m乙酸己路，加热至辉十，再或复次最后%mL乙酸乙醛，孕室室温后转人具展置的10mL范瓶中。用落量乙醛乙雷洗涤蒸发血井人浓辅瓶中，将改缩瓶蓝95水浴锅上比蒸汽加热，挥干，将却后用0.2m含20%甲序的PH定弃，供EI.ISA检测用。9.2ELISA检
9.2.1用DON-BSA(20/ml)包谈醛标微孔板，每10L，4过夜，9.2.2避标版用P1ST洗3欢每次？min后，加人不浓度的ON标准落减（作标准断线试样提取减（检融就样中的毒末含重>抗体择游的能合流（11)，乱1001：读滨合浪应于被带的前一天促好,4么过夜，备用,资 37℃: 1 。9.2.3酵标板洗3次，每次ni量，加人酵标二抗，每孔13μ1.,41.5h。9.2.4同上选洗涨后，加人底物箱液L即收51.TM10mgTMB率于1ml.二甲F酷胺落液加10m1.底懒领冲减加103G%过填化氧漏句了，每孔10Vr，3心39mi。9.2.5T2m01.1配酸请整止，率乳50于450处需宽册度位。57
GR/T 5009.111—2003
10结果计算
按式(2计算，
武中：
K——呕吐每求银度，单位为纳克每克（m/）！。酵标微孔惊上所测得的呕吐市案的含量（根屠标准山裁求得），单位为纳克（；式详极收来的述积.单这为毫升(L)V，—加人样限的体积，单位为率升（mL)D——样液的总稀帮倍数！
试样质单，单位为克(g）
11精密康
生回发性杀件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15治。Eg
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