本标准规定了用荧光法和高压液相色谱法测定维生素B2的方法。本标准方法一适用于乳粉中维生素B2含量的测定；方法二适用于婴幼儿配方食品和乳粉中维生素B2的测定。 GB/T 5413.12-1997 婴幼儿配方食品和乳粉 维生素B2的测定 GB/T5413.12-1997 标准下载解压密码：www.bzxz.net

GB/T 5413. 12--1997
本标准给出两种方法，方法一是荧光法，重现性好，准确度高。方法二是高压液相色谱法，测定速度快。
本标推方法一为仲裁法。
本系列标准从实施之日起，代替GB5413一85。本标准由中国轻工总会提出。
本标准由全国乳品标准化中心归口。本标准负责起草单位，国家乳制品质量监督检验中心、浙江省轻工业研究所。本标准参加起草单位：卫生部食品卫生监督检验所、哈尔滨森永乳品有限公司、雀巢（中国）投资服务有限公司。
本标准主要起草人：李茂胜、任一平、黄百芬、郎昭斌、陈青俊、王芸。268
中华人民共和国国家标准
婴幼儿配方食品和乳粉
维生素B2的测定
Milk powder and formula foods for infant and young children--Determination of vitamin B2 content1范围
本标准规定了用荧光法和高压液相色谱法测定维生素B的方法。GB/T 5413.12-1997
代替GB5413--85
本标准方法一适用于乳粉中维生素B含量的测定；方法二适用于婴幼儿配方食品和乳粉中维生素B2的测定。
方法荧光法
2方法捷要
样品在稀盐酸溶液中经消化，调整pH值，过滤，除去蛋白质等物质后，滤液加高锰酸钾氧化除去干扰物，此溶液中维生素B,在激发波长440nm、发射波长565nm下可产生最大荧光强度，与标准样品做对照试验，可得维生素B,含量。
3试剂
所有试剂，如未注明规格，均指分析纯，所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。3. 1 盐酸:c(HCI)为 0. 1mol/L。3.2氢氧化钠：c(NaOH)为400g/L。3.3冰乙酸。
3.4高锰酸钾：c(KMnO,)为40g/L。3.5过氧化氢：体积分数为3%。
3.6连二亚硫酸钠(NaS,O,·2H,O)。3.7维生素 B,标准溶液
3.7.1维生素B,标准贮备液，浓度为100μg/mL。准确称取于暗处五氧化二磷条件下干燥过夜的维生素Bz50.0mg，溶于0.02mol/L的乙酸中，定容至500mL，甲苯条件下于冰箱中保存。3.7.2维生素Bz标准中间液，浓度为10μg/mL。用0.02mol/L乙酸稀释100mL标准贮备液至1000mL，在甲苯条件下于冰箱中保存。3.7.3标准工作液，维生素Bz的浓度为1产g/mL。用水稀释10mL标准中间液至100mL。当天配制。国家技术监督局1997-05-28批准1998-09-01实施
4仪器
常用实验室仪器及：
4.1荧光分光光度计。
5操作步骤
5.1抽提
GB/T 5413. 12-1997
于150mL三角瓶中准确称取5g左右样品，加入盐酸（3.1)60ml，用铝箔纸盖住瓶口，在137.2~161.7kPa压力下（125℃）消化30min后用氢氧化钠（3.2）调节pH至5.8，再用盐酸（3.1）调节pH至4.5，将此抽提液移入100mL容量瓶中以蒸馏水定容，过滤，吸取25mL滤液于250mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。
5.2抽提液的氧化
5.2.1吸取4份样品抽提液（5.1），每份10mL，于4个试管中。5.2.2于其中二个试管各加1mL标准工作液（3.7.3）。5.2.3于另外二个试管中各加1mL水。5.2.4加1mL冰乙酸（3.3)于每一试管中，混匀。5.2.5加高锰酸钾溶液（3.4)0.5mL.于每个试管中，混匀。5.2.62min后各加过氧化氢（3.5)0.5mL，混匀，使其褪色。5.3荧光测定
依次测定每管荧光强度，激发波长440nm，发射波长565nm。样液管（未加标准工作液者)经荧光测定后，各加20mg连二亚硫酸钠（3.6)混匀，立即测定荧光，在5s内读数。
6分析结果的衰述
(, -I)×c× D
样品中维生素B2含量（mg/100g）=(T. -7, ×10×m 100× 100
式中：1.-
空白样品荧光值；
I.样品荧光值；
1.样品加标样荧光值；
c—-标样质量浓度，μg/mL；
D样品稀释倍数；
m—-样品的质量，g。
注: Ts- s
Is - I
值必须在0.66～1.5之间。
7允许差
同样品两次测定值之差不得超过两次测定平均值的5%。方法二高压液相色谱法
8方法提要
....(1)
样品在稀盐酸环境中高温水解、酶解，经ODSC1g反相色谱柱分离，在荧光检测器（E：462，Em：522nm）中检测，用外标法定量维生素B2的含量。270
9试剂
GB/T5413.12-1997
所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。9.1浓盐酸。
9.2无水乙酸钠。
9.3冰乙酸。
9.4甲醇：色谱纯。
9.5核黄素（维生素B,)：标准品。9.6盐酸溶液：c(HCl)为0.1mol/L。吸取4.5mL浓盐酸，溶于500mL去离子水。9.7盐酸溶液：c(HCl)为0.01mol/L。吸取上述0.1mol/L盐酸50mL，配制成500mL。9.8乙酸钠溶液（pH=4.5）：c（NaAc）为0.05mol/L。称取4.10g乙酸钠固体，配成1000mL，并用冰乙酸调至 pH=4. 5。wwW.bzxz.Net
9.9乙酸钠溶液：c(NaAc）为2.0mol/L。称取16.61g乙酸钠，配制成100mL。9.10混合酶溶液：30g/L。称取淀粉酶和木瓜酶各3.6g，溶于100mL2mol/L乙酸钠溶液。9.11流动相配制：用0.05mol/L乙酸钠溶液与甲醇按适当比例混合。9.12标准溶液
9.12.1标准储备溶液，维生素B2的浓度为500μg/mL。精确称取0.0500g维生素Bz，用0.01mol/L盐酸(9.7)溶解并定容于100mL容量瓶中，放入冰箱中保存。
9.12.2标准工作液，维生素B2的浓度为0.5μg/mL。在测定时，将标准储备液用重蒸水再稀释1000倍，所得溶液经0.3μm滤膜过滤。10仪器与设备
常用实验室仪器及：
10.1高效液相色谱仪或具同等性能的高效液相色谱仪。10.2荧光分光仪（带9μL流动池）或具波长可调功能的同等性能荧光检测器。10.3C1s反相色谱柱(dp5μm，25cm×4.6mm）或具同等性能的色谱柱。10.4组织捣碎机（10000~~12000r/min）。10.5高压杀菌锅。
11操作步骤
11.1样品处理
11.1.1称样：将样品放入捣碎机中捣碎后，精确称取 5.0～10.0 g(内含维生素B25μg以上)于三角瓶中。
11.1.2水解：加适量的盐酸（9.6),控制样液中酸浓度在0.1mol/L左右，将三角瓶内的样液摇匀后，放入高压杀菌锅内，在121℃下保持30min，待冷却后取出，轻摇数次。11.1.3酶解：冷却至40℃以下，分别加入2.5mL混合酶液（9.10），摇匀后，置于37℃培养箱中过夜。
11.1.4定容：用0.1mol/L氢氧化钠将样液pH值调节至6.0左右，再用二次重蒸水定容至100mL。11.1.5过滤：样液经定量滤纸过滤，接取少量滤液以备进样。11.2样品测定
11.2.1色谱条件
流动相：0.05mol/L乙酸钠溶液（9.8）：甲醇（9.4)（65：35，体积比）。271
速：1.00mL/min。
GB/T5413.12—1997
检测波长：激发波长462nm，发射波长522nm。12分析结果的表述
cX F×V× 100
样品中维生素Bz的含量（mg/100g）=m × 100
式中：c—进样样液的浓度，μg/mL；F—稀释倍数；
V—定容容积,mL，
一样品的质量，g。
13允许差
13.1重复性
同一样品两次测定结果之差不得超过平均值的5%。13.2重现性
同一样品在两个实验室测定结果之差不得超过平均值的5%。272
，(2)
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