本标准规定了用微生物法测定叶酸(叶酸盐活性)的方法。本标准适用于婴幼儿配方食品和乳粉中叶酸(叶酸盐活性)的测定。 GB/T 5413.16-1997 婴幼儿配方食品和乳粉 叶酸(叶酸盐活性)的测定 GB/T5413.16-1997 标准下载解压密码：www.bzxz.net

GB/T5413.16-1997
本标准等效采用美国公职分析化学师协会（AOAC)方法。本系列标推从实施之日起，代替GB5413—85。本标准由中国轻工总会提出。
本标准由全国乳品标推化中心归口。本标准负责起草单位：国家乳制品质量监督检验中心。本标准参加起草单位：卫生部食品卫生监督检验所、浙江省轻工业研究所、哈尔滨森永乳品有限公司、雀巢(中国)投资服务有限公司。本标准主要起草人：殷晓红、王芸、杨金宝、张玉杰。287
中华人民共和国国家标准
婴幼儿配方食品和乳粉
叶酸（叶酸盐活性）的测定
Milk powder and formula foods for infant and young children--Determinatfon of folic acid (folate activity)1范围
本标准规定了用微生物法测定叶酸(叶酸盐活性)的方法。本标准适用于婴幼儿配方食品和乳粉中叶酸(叶酸盐活性)的测定。2方法原理
叶酸盐的活性通过干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）的生长情况来评价。3试剂、菌种和培养基
GB/T 5413.16—1997
代替GB5413—85
所有试剂,如未注明规格，均指分析纯；所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。3.1鸡胰腺：称取100mg干燥的鸡胰腺，20mL.蒸馏水，搅拌15min，离心10min（3000r/min），取上清液用。现用现配。
3.2生理盐水：称0.9g氟化钠（分析纯）于100mL容量瓶中，稀释至刻度，振荡溶解。分装10mL到每个培养管中，盖上盖，121℃灭菌20min，每周准备一次。3.3磷酸缓冲液：c(H,PO,)为0.05mol/L，含有抗坏血酸。溶解50mg抗坏血酸于100mL0.05mol/L磷酸缓冲液中，现用现配。
3.4叶酸，标准品。
3.5浓氨水。
3.6甲苯。
3.7菌种：干酪乳杆菌（Lactobacillus casei)。3.8培养基。
3.8.1乳酸杆菌琼脂培养基：陈化乳15g，酵母漫裔5g，葡萄糖10g，番茄汁100mL，磷酸二氢钾2g，聚山梨糖单油酸酯1g，琼脂10g，加蒸馏水至1000mL，pH6.8士0.2（25℃）。3.8.2乳酸杆菌肉汤培养基：陈化乳15g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，番茄汁100mL，磷酸二氢钾2g，聚山梨糖单油酸酯1g，加蒸馏水至100mL，pH6.8土0.2(25℃）。3. 8. 3 叶酸测定用培养基:酪蛋白陈 10g,葡萄糖 40g,乙酸钠 40g,磷酸氢二钾 1g,磷酸二氢钾 1g,DL色氨酸0.2g，L-天门冬氨酸0.6g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，硫酸腺嘌呤10mg，盐酸鸟嘌呤10mg，尿嘧啶10mg，黄嘌呤20mg，聚山梨糖0.1g，谷光甘肽5mg，硫酸镁0.4g，氟化钠20mg，硫酸亚铁20mg，硫酸锰 15mg，核黄素 1mg,p-氨基苯甲酸 2mg，维生素 B.4mg,盐酸硫胺素 400μg，泛酸钙 800μg，烟酸800μg，生物素20μg，加蒸馏水至1000mL，pH6.7士0.1（25℃）。3.9氢氧化钠溶液：c(NaOH)为0.1mol/L。国家技术监督局1997-05-28批准288
1998-09-01实施
4仪器
常用实验室仪器及：
4.1培养箱。
4.2灭菌釜。
4.3培养管和帽。
4.4试管振荡架。
4.5接种针和接种环。
4.6 pH计。
4.7离心机。
5制备
5.1菌种的制备
GB/T 5413.16—1997
5.1. 1将纯菌种植物乳杆菌(Lactobacillus casei)从菌种培养基上接种到三个转接培养基试管中,37℃培养24h，每月接种一次，标好，贮于冰箱中。再以每月接种的培养管（4.3)的一支中再接种1支转接培养基，37℃培养24h，每周做一次这样的转接，每周从接种管中接种4～5支转接培养基接种管，37℃培养24h，标好，作为每日测定用。每月月初从月接种管中重新接种3个转接管保存新菌种。5.1.2从日接种管中接种一管于菌种培养基中，37℃培养24h。在无菌条件下离心该培养液10min（2000r/min），倾去上清液，再用10mL生理盐水（3.2）将细菌细胞清洗，再离心10min（2000r/min），倾去上清液，再用另外的10mL生理盐水（3.2)清洗。如前面一样离心，弃去上清液，再加10mL生理盐水(3.2）。吸1mL该菌悬液于10mL生理盐水（3.2)中，混合均匀。5.2标准溶液的制备
5.2.1标准贮备液，叶酸的浓度500μg/mL。精确称取55~~56mg叶酸标准品（3.4），用50mL蒸馏水定量地转入100mL容量瓶中，加2mL氨水（3.5）。溶液制备后，计算溶液的体积，要求贮备液中叶酸盐的浓度为500μg/mL：贮备液体积(mL)=㎡×,1000×c
100×500
或简化为：
贮备液体积（mL）
式中：m标样的质量,mg;
c——标样的纯度，这/100g。
用蒸馏水稀释溶液至刻度，用吸管加蒸馏水到所要求的计算得到的体积，充分混合，放入红色或棕色瓶子中，于冰箱。保存期为4个月。5.2.2标准中间液，叶酸的浓度50μg/mL。精确吸取10mL标准贮备液（5.2.1)液于100mL棕色或红色容量瓶中，用蒸馏水稀至刻度，充分混合，贮于冰箱中，保存期1个月。5.2.3标准工作液，叶酸的浓度0.1ng/mL。吸取1mL标准中间液（5.2.2)于100mL棕色容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混合。再吸该液1mL于100mL棕色容量瓶中，定容，混合。再从上液中吸5mL于250mL棕色容量瓶中，用0.05mol/L磷酸缓冲液定容到刻度，混合，即为标289
精确称取定量的样品（样品中约含有5μg叶酸）于100mL烧杯中，用25～30mL水复原样品，定吸1mL稀释样品和1mL鸡胰腺（3.1)于一个18mm×150mm的带螺旋盖的培养试管中，充分混合。加18mL0.05mol/L含抗坏血酸的磷酸缓冲液（3.3），再加1mL甲苯（3.5）。作一个空白对照管，吸于37℃C培辨样品管和空白管16h，再于121℃灭菌10min，之后离心，用0.05mol/L磷酸缓冲液稀1mL蒸馏水和1mL鸡胰腺于空白管中，也加0.05mol/L缓冲液（3.3)18mL及1mL甲苯（3.5）。10
吸取定量的样品，大约含5μg的叶酸于100mL容量瓶中，用水定容至刻度，接6.1.3。5
直接灭菌所有的试管，制冷到培养温度或迅速放入循环水浴内，以使颜色形成最浅。保证加热和制1
无菌的接种每个管，均加入一滴适当的接种物。除标准管No.7以外。盖上盖，充分振荡混合所有4
按表1顺序加入蒸馏水，标溶液和叶酸测定用培养基于培养管中，一式三份。5
试管被任何外来微生物污染则测定无效。通过对每个试管的视觉检查进行反应的预测，未接种管是2
量地转入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。接6.1.3步骤继续。5
GB/T 5413. 16-1997
冷条件均匀（灭菌管数过多或距离太近，在灭菌锅中都可产生不良影响）。121℃灭菌10min。7
按表2顺序加蒸馏水、样品溶液和叶酸测定用培养基于培养管内，一式三份。准工作液（0.0001ug/mL或0.1ng/mL）。每次测定前制备。0
6.1.3溶液中叶酸的质量浓度大约为0.05μg（50ng）/mL。3
1）试管 No.3~7中加低浓度标准溶液;No. 8~10中加高浓度标准溶液5
释，得到叶酸盐的质量浓度约为.0.1ng/mL的溶液。4
在28～~40℃之间选择一个恒定温度（±0.5℃），培养60～72h。5
6.1测定溶液的制备
6.1.1粉状样品
6.1.2液体样品
6操作步骤
6.2标准曲线的制备
标准溶液\,mL
试管号 No.
清的，标准和样品中无其他生长。蒸馏水,mL
培养基,mL
6.3测定液
试管号No.
蒸馏水，mL
样品，mL
培养基，mL
6.4灭菌
6.5接种
6.6培养
6.7测定（酸度法）
6.7.1滴定
GB/T5413.16—1997
用溴麝香草酚蓝作指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠(3.9)滴定每个管中溶液，或以pH6.8作为电位滴定终点。如果接种空白滴定反应等于或高于未接种空白水平的1.5mL，则测定结果应忽略不计。通常标准溶液在5.0mL的反应等于0.1mol/L氢氧化钠8～12mL的滴定度。6.7.2测pH值
在培养之后读出管内容物的pH值，近似至0.01pH值单位。6.8计算
对于每个标准溶液作出一个浓度反应曲线（酸度，pH值，透射率或吸收值），每个管中分别含有相对应的参考标准含量。
对每个水平的检验溶液进行维生素的定量测定，废弃任何低于0.5mL标准溶液的吸收值或高于4.5mL标准溶液的吸收值。
对每个水平的检验溶液，计算其每毫升中的维生素含量。计算所得值的平均数，每个管的测得值不得超过该平均值的士15%。如果所得到的管数少于所测定的四种水乎的稀释液的管数的2/3，用于计算样品浓度的数据就是不充分的。如果剩余管数是原来管数的2/3或更多，则可根据平均值计算其样品中的含量。
7分析结果的表述
样品中叶酸含量(mg/100g或100mL）=［（X× D）EB}×式中：X—不同水平检验溶液其每毫升中的叶酸含量值,ng;D—1mL样品在经过酶处理后的稀释度；EB—酶处理液空白管中叶酸含量值，ng/mL；mwww.bzxz.net
8允许差
最初称（吸）取样品的质量，g（或mL）。同一样品的两次测定值之差不得超过两次测定平均值的10%。100
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