本标准规定了用微生物法和高压液相色谱法测定泛酸的方法。本标准方法一适用于婴幼儿配方食品和乳粉中泛酸的测定，方法二适用于乳粉中泛酸的测定。 GB/T 5413.17-1997 婴幼儿配方食品和乳粉 泛酸的测定 GB/T5413.17-1997 标准下载解压密码：www.bzxz.net

GB/T 5413.17—1997
本标准给出两种方法，方法一是微生物法，为等效采用美国公职分析化学师协会(AOAC)的方法：虽然操作步骤繁杂，但测定结果准确度高。方法二是高压液相色谱法，是经实验确定的一种快速、准确的方法。
本标准方法一为仲裁法。
本系列标准从实施之日起，代替GB5413—85。本标准由中国轻工总会提出。
本标准由全国乳品标准化中心归口。本标准负责起草单位：国家乳制品质量监督检验中心。本标准参加起草单位，卫生部食品卫生监督检验所、浙江省轻工业研究所、哈尔滨森永乳品有限公司、雀巢（中国)投资服务有限公司。本标准主要起草人：张玉杰、王芸、殷晓红、杨金宝、吕为群。292
中华人民共和国国家标准
婴幼儿配方食品和乳粉
泛酸的测定
Milk powder and formula foods for infant and young children-Determination of pantothenic acid范圈
本标准规定了用微生物法和高压液相色谱法测定泛酸的方法。GB/T5413.17-—1997
代替GB5413—85
本标准方法适用于婴幼儿配方食品和乳粉中泛酸的测定，方法二适用于乳粉中泛酸的测定。方法微生物法
2方法原理
利用植物乳杆随(Lactobacillus plantarum)的繁殖量与样品中的泛酸含量成正比的关系可计算出样品中的泛酸含量。
3试剂、菌种和培养基
所有试剂，如未注明规格，均指分析纯，所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。3.1生理盐水：9g氯化钠溶于1000mL容量瓶中。3.2泛酸钙：标准品。
3.3乙酸：c(HAc)为0.2mol/L。吸12mL冰乙酸用蒸馏水稀释至1L。3.4甲苯。
3.5乙酸钠：c(NaAc）为0.2mol/L。溶解16.4g无水乙酸钠于水中，稀释至1000mL。3. 6 菌种-植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。3.7培养基
3. 7. 1乳酸杆菌琼脂培养基：光解炼 15g,酵母浸膏 5g，葡萄糖-10g，番茄汁 100mL;磷酸二氢钾 2g，聚山梨糖单油酸酯1g，琼脂10g，加蒸馏水至1000mL，pH6.8±0.2(25℃）。3.7.2乳酸杆菌肉汤培养基：光解陈15g，酵母漫膏5g，葡萄糖10g，番茄汁100mL，磷酸二氢钾2g，聚山梨糖单油酸酯1g，加蒸馏水至1000mL，pH6.8土0.2(25℃）。3.7.3泛酸测定用培养基：葡萄糖40g，乙酸钠20g，无维生素酸水解酪蛋白10g，磷酸氢二钾1g，磷酸二氢钾1g，L-胱氨酸0.4g，L-色氨酸0.1g，硫酸镁0.4g，氯化钠20mg，硫酸亚铁20mg，硫酸锰20mg，硫酸腺嘌呤20mg，盐酸鸟嘌呤20mg，尿嘧啶20mg，胡萝卜素400μg，盐酸硫胺素200μg，生物素0.8μg?p-氨基苯甲酸200μg，烟酸1mg，盐酸吡哆醇800μg，山梨糖单油酸酯0.1g，加蒸馏水至1000mL，pH6.7±0.1(25℃)。
国家技术监督局1997-05-28批准1998-09-01实施
4仪器
常用实验室仪器及分光光度计。5制备
5.1菌种的制备
GB/T5413.17--1997
5.1.1将保存在直柱状固体培养基中的植物乳杆菌接种到新的乳酸杆菌琼脂培养基中，培养后再继代培养一次，然后将其转接到乳酸杆菌肉汤培养基中培养后备用。5.1.2将5.1.1中的菌悬液以2000r/min离心2~~3min，倾出上清液，加入10mL生理盐水（3.1），搅匀，再离心2~~3min，如此清洗3次，吸1.0ml该菌悬液于10mL生理盐水（3.1）中。5.1.3用721型分光光度计，于550nm波长下，以生理盐水（3.1)做对照，测5.1.2菌悬液的浊度值，此值应在60%～80%之间。
5.2标准溶液的制备
5.2.1泛酸标准贮备液浓度40μg/mL。精确称取45~~55mg泛酸钙标准品（3.2），溶入500mL蒸馏水中，加10mL乙酸（3.3），加100mL乙酸钠（3.5）用水稀释至泛酸钙精确浓度为43.47μg/mL（即泛酸浓度为40μg/mL），加甲苯（3.4）贮于冰箱中。
5. 2.2泛酸中间贮备液：浓度 1μg/mL。取25mL标准贮备液（5.2.1），加入大约500mL蒸馏水，乙酸10mL（3.3），乙酸钠100mL（3.5），再用水稀释至1L。加甲苯（3.4)贮于冰箱中。5.2.3泛酸标准工作液：高浓度的为10ng/mL，低浓度的为5ng/mL。吸5.0mL中间贮备液（5.2.2），用蒸馏水稀至500.0mL。每次测定前制备。吸5.0mL.中间败备液（5.2.2），用蒸馏水稀至1000mL。每次测定前制备。.6测定
6.1样品的处理
称取一定量的样品，加入10mL缓冲液（称24.2gTrizmaBase溶入200mL水中即可），再加足量的水，121℃水解15min，冷却，调pH至4.5，然后定容到250mL，过滤，吸4mL滤液，稀释至泛酸的浓度约为 5ng/ml,待用。
6.2标准曲线的制备
按表1顺序加蒸馏水、标准溶液和泛酸测定用培养基于培养管中，一式三份。表1
试管号 No.
蒸馏水，mL
标准溶液\,mL
培养基.mL
1),试管 No. 3~7. 中加低浓度标准工作液,No. 8~10 中加高浓度标准工作液。6.3测定液样品
按表2顺序加蒸缩水、样品溶液和泛酸测定用培养基于培养管内，一式三份。294
试管号No.
蒸馏水，mL
样品溶液，mL
培养基,mL
6.4接种
GB/T 5413.17—1997
将6.2和6.3中所有的试管于121℃杀菌5min，然后迅速冷却。将5.1.2中的菌悬液用毛细滴管向上述试管内各加一滴（其中标准溶液中试管No1除外）)，混匀，37℃士0.5℃培养19～20h。6.5测定
以接种空白管做对照，测最高浓度标准样管的透光率，2h后重新读数，二次结果透光率2%，则取出全部检验管测其透光率，并记录。7计算
以标样泛酸含量作横坐标，透光率为纵坐标作工作曲线。根据样品测得的透光率，从标准曲线中查得泛酸含量的平均值，再根据式（1)计算：样品中泛酸含量(mg/10g或mg/10mL）=需×1000×100…m
式中：从曲线中查得样品中泛酸的平均含量，μg；F
稀释因子，
m--—样品的质量（或体积），g（或mL）。8允许差
同一样品两次测定值之差不得超过两次测定平均值的10%。方法二高压液相色谱法
9方法提要
样品经水提取，过滤，除去蛋白质后，用高压液相色谱测定滤液中泛酸羧基的紫外吸收。10试剂
所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。10.1硅酮树脂：食品添加剂。
10. 2 盐酸:c(HCI)为 0. 1mol/L。10.3硫酸锌：c(ZnSO)为15g/L。10.4乙腈：光谱纯。
10.5磷酸二氢钾：c(KH,PO,)为0.02mol/L。称取2.72g磷酸二氢钾，加水溶解成1000mL。10.6乙腈-0.02mol/L磷酸二氢钾溶液：体积比1：9。向1体积乙中加入9体积的0.02mol/L磷酸二氢钾,用盐酸调节 pH 为 3。
11仪器
常用实验室仪器及：
11.1离心机。
11.2滤膜过滤器：滤膜1.0μm。11.3五氧化二磷干燥器。
11.4高压液相色谱仪：带紫外检测器。12操作步骤
12.1样品溶液的制备
GB/T 5413. 171997
12.1.1准确称取样品约10g，加60mL水和1滴硅酮树脂（10.1)后，转入离心管中，用盐酸溶液（10.2)调节pH为4～5，加入10mL硫酸锌溶液（10.3)充分混合，离心分离。12.1.2上清液用滤纸过滤，用100mL容量瓶收集滤液，离心管中残渣用少量水冲洗于同一滤纸上，用少量水洗滤纸，洗液与滤液合并，加水至100mL。经滤膜过滤器（11.2)过滤后作为样品溶液。12.2标准溶液的制备
12.2.1泛酸标准贮备液：浓度为1mg/mL。推确称取在干燥器（11.3)中干燥的泛酸钙1.0918g，加水溶解成1000mL。12.2.2泛酸标准工作液
准确吸取标准贮备液（12.2.1）1，2，4,8,12mL，分别加水成100mL，作为标准工作液，泛酸浓度分别为10,20,40,80，120μg/mL。12.3测定条件
填充剂：化学结合型硬脂硅烷。色谱柱：内径6.2mm，长25cm。
洗脱液：乙腈-0.02mol/L磷酸二氢钾（1：9）。流速：lmL/min。
测定波长：200nm。
1柱的内径和长度可自由选择。
2洗脱液组成比和流速可根据色谱柱情况而改变，没有统一规定。泛酸的保留时间可设定为 8～~12min。3泛酸的最大吸收在波长194nm附近，但是移动相在此处也有吸收，所以测定波长定为200nm。12.4标准曲线
分别吸取10μL标准工作液（12.2.2），注入高压液相色谱中，根据峰高绘制标准曲线。注；进样量、灵敏度与高压液相色谱的注入方式有关，因此进样量可在3~20μL之间变动。12.5样品测定
准确吸取样品溶液（12.1)10μL，注入高压液相色谱仪中，将所得峰高从标准曲线中求出样品溶液中泛酸的浓度。
13分析结果的表述
100××100
样品中泛酸含量（mg/100g）二
式中：c—样品溶液中泛酸的质量浓度，μg/100g；一称取样品的质量，。
泛酸钙含量（mg/kg）=泛酸含量（mg/100g）×1.087泛酸钠含量(mg/kg）=泛酸含量(mg/100g）×1.10014允许差www.bzxz.net
同-样品的两次测定值之差不得超过两次测定平均值的10%。296
（2）
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