本标准规定了用微生物法测定游离生物素的方法。本标准适用于婴幼儿配方食品和乳粉中游离生物素的测定。 GB/T 5413.19-1997 婴幼儿配方食品和乳粉 游离生物素的测定 GB/T5413.19-1997 标准下载解压密码：www.bzxz.net

GB/T5413.19-1997
本标准等同采用美国公职分析化学师协会（AOAC)方法。本系列标准从实施之日起，代替GB5413—85。本标准由中国轻工总会提出。
本标准由全国乳品标准化中心归口。本标准负责起草单位：国家乳制品质量监督检验中心。本标准参加起草单位：卫生部食品卫生监督检验所、浙江省轻工业研究所、哈尔滨森永乳品有限公司、雀巢(中国)投资服务有限公司。本标准主要起草人：张玉杰、王芸、杨金宝。300
中华人民共和国国家标准
婴幼儿配方食品和乳粉
游离生物素的测定
Milk powder and formula foods for infant and young children-Determination of free biotin content1范圈
本标准规定了用微生物法测定游离生物素的方法。本标准适用于婴幼儿配方食品和乳粉中游离生物素的测定。2方法原理
GB/T 5413.19—1997
代替GB5413-85
通过植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)生长情况来测定游离生物素含量。3试剂、菌种和培养基
所有试剂，如未注明规格，均指分析纯所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。3.1生物家：标准品。
3.2乙醇体积分数为50%。
3.3菌种：植物乳杆菌(Lactobacillus plantorum）。3.4培养基
3. 4.1乳酸杆菌琼脂培养基：光解陈15g，酵母浸膏 5g，葡萄糖10g，番茄汁100mL,磷酸二氧钾 2g，聚山梨糖单油酸酯1g，琼脂10g，蒸馏水1000mL，pH6.8士0.2（25℃）。3.4. 2乳酸杆菌肉汤培养基：光解陈15g，酵母浸膏 5g，葡萄糖 10g，番茄汁 100mL,磷酸二氢钾 2g，聚山梨糖单油酸酯1g，蒸馏水1000mL，pH6.8士0.2(25℃）。3. 4.3生物素测定用培养基：维生素测定用酪蛋白氨基酸12g,葡葡糖 49g,乙酸钠 20g,L-胱氨酸0.2g，DL色氨酸0.2g，硫酸腺嘌呤20mg，盐酸鸟嘌呤20mg，尿嘧啶20mg，盐酸硫胺素2mg，核黄素2mg，烟酸 2mg，泛酸钙2mg，盐酸吡哆醇2mg，p-氨基苯甲酸200μg，磷酸氢二钾1g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.4g，氯化钠20mg，硫酸亚铁20mg，硫酸锰20mg，加蒸馏水至1000mL，pH6.7士0.1（25℃）。4仪器
常用微生物实验室仪器及pH计。5制备
5.1菌种的制备
5.1.1液体培养基的制备
吸取定量的基础液体培养基，如入等量的蒸馏水，每个培养管分装10mL，盖上盖，121℃灭菌15min。迅速将灭菌管冷却，避免颜色形成。贮于冰箱中。国家技术监督局1997-05-28批准1998-09-01实施
GB/T 5413.19—1997
5.1.2植物乳杆菌（Laclobacilusplanlarum）贮备管的制备将所用的微生物菌种接种到2个以上琼脂培养基试管内，在28～40℃之间选择个恒定温度（士0.5℃）培养6～24h，完成后放入冰箱。在使用新的菌种用于个测定时，要在1～2周内做儿个继代转接。不要用保存周以上的培养基接种，培养基在保存过程中不要打开。5.1.3接种的准备
将植物乳杆菌（Laclobacillusplanlarum）（3.3)转接到一个无菌的10mL液体培养基中，得到一个菌悬液。
5.2标准溶液的制备
5.2.1生物素标准贮备液：浓度50μg/mL。精确称取50～60mg生物素标样（3.1）（从干燥器中），用乙醇（3.2）稀释，得到50μg/mL的生物素溶液，贮于冰箱中。
5.2.2生物素标准工作液：浓度0.1ng/mL。吸1mL标准贮备液（5.2.1)，用水稀释到1000mL，再分别吸此稀释溶液各1mL，一个稀释到500mL，作为高浓度标准溶液，个稀释到1000mL，作为低浓度标准溶液。每次现用现配。5.3玻璃仪器的准备
使用焰状活性剂对硬玻璃测定管及其他必要的玻璃器Ⅲ进行清洗（月桂磺酸钠，是一一种合适的清洗剂）检验微生物对少数生长因子和许多清洗剂具有很高的敏感性，因此，清洗之后要求在250℃干热条件下，加热1～2h。
6操作步骤
6.1样品的处理
6.1.1干粉样品
精确称取一定量样品，该样品应含0.2～0.5mg生物素。继续6.1.3步骤。6.1.2液体样品
吸一定量的液体样品，该样品应含0.2～0.5mg生物素。继续6.1.3步骤。6.1.3样品的提取
加水，使样品总体积为150mL，混合后，用1mol/L盐酸调pH为4.5~4.6，定量转到250mL容量瓶中，用水定容，充分混合，用滤纸过滤，弃去最初的几毫升，吸5mL滤液，用水定容到100mL。6.2标准曲线的制备
按表1顺序加入蒸馏水、标准溶液和维生素B12测定用培养基于培养管中，一式三份。表1
试管号No.
蒸馏水，ml.
标准溶液\,mL
培养基,mL
1）试管 No.3~7中加低浓度标准溶液,No.8~10中加高浓度标准溶液。6.3测定液
按表2顺序加蒸馏水、样品溶液和维生素B12测定用培养基于培养管内，式三份。302
试管号No.
蒸馏水，mL
样品，mL
培养基，mL
6.4灭菌
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直接灭菌所有的试管，制冷到培养温度或迅速放入循环水浴内，以使颜色形成最浅。保证加热和制冷条件均匀（灭菌管数过多或距离太近，在灭菌锅中都可产生不良影响）。121℃灭菌10min。6.5接种
无菌地接种每个管，均加入一滴适当的接种物。除二组（或三组）中含有0.0mL标准溶液（未接种空白管）以外。盖上盖，充分振荡混合所有管。6.6培养
在28~~40℃之间选择一个恒定温度（士0.5℃），培养60~72h。6.7测定（酸度法）
试管被任何外来微生物污染则测定无效。通过对每个试管的视觉检查，进行反应预测，未接种管是清的，标准溶液和样品中应无其他微生物生长。6.7.1滴定
用溴麝香草酚蓝作指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠滴定每个管中溶液，或以pH6.8为电位滴定终点。如果接种空白滴定反应等于或高于未接种空白水平的1.5mL，则测定结果应忽略不计。通常标准溶液在5.0mL的反应等于0.1mol/L氢氧化钠8~~12mL的滴定度。6.7.2测pH值
试管被任何外来微生物污染则测定无效。通过对每个试管的视觉检查进行反应预测，未接种管是清的，标准溶液和样品中应无其他微生物生长。在培养之后读出管内容物的pH值，近似到0.01pH值单位。7分析结果衰述
样品中生物素的含量（μg/100g或μg/100ml.）=式中：X每毫升测定溶液中生物素含量的平均值，ml；F 稀释因子;
m--样品的质量或体积，g或mL。8允许差
同一样品两次测定值之差不得超过两次测定平均值的10%。X
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