本标准规定了用高效液相色谱法测定维生素预混料中维生素B12的方法。本标准适用于维生素预混料、维生素B12预混制剂中维生素B12的测定。检测范围为每千克样品中维生素B12含量大于0.25mg。 GB/T 17819-1999 维生素预混料中维生素B12的测定 高效液相色谱法 GB/T17819-1999 标准下载解压密码：www.bzxz.net

GB/T17819--1999
维生素预混料中维生素B1测定方法尚无国际标准。本标准参考《色谱科学杂志》第15卷和法国罗纳普朗克动物营养公司提出的分析方法，该法简捷、快速、准确，在技术内容上采用其中技术条件，在编写规格上，依据GB/T1.1--1993《标准化工作导则第1单元：标准的起草与表述规则第1部分：标准编写的基本规定》和GB/T1.4-1988《标准化工作导则化学分析方法标准编写规定》。本标准的附录A是标准的附录。
本标准由全国饲料工业标准化委员会提出并归口。本标准由国家饲料质量监督检验中心(北京)负责起草。本标准主要起草人：李兰、陈必芳、梁冬生。276
1范围
中华人民共和国国家标准
维生素预混料中维生素B12的测定高效液相色谱法
Determination of vitamin B2 in vitamins premix-High-pressure liquid chromatographyGB/T17819--1999
本标准规定了用高效液相色谱法测定维生素预混料中维生素B2的方法。本标准适用于维生素预混料、维生素B12预混制剂中维生素B12的测定。检测范围为每干克样品中维生素B2含量大于0.25mg。
2方法原理
试样中维生素B12用水提取，经高效液相色谱反相柱分离，其峰面积与维生素B2的含量成正比。3试剂和材料
本标准所用试剂除特殊注明外,均为优级纯，水为去离子水。3.1乙睛：色谱纯。
3.2正磷酸溶液。
3.325%乙醇溶液。
3.4维生素B12标推溶液。
3.4.1维生素B12标准贮备溶液：准确称取0.1000g维生素B12纯品（符合USP），溶解于100mL乙醇溶液（3.3)中，并稀释定容至刻度，摇匀。该标准贮备液每毫升含维生素B1z21mg。3.4.2维生素B2标准工作液：确吸取维生素B2标推贮备液（3.4.1)1mL于50mL容量瓶中，用移动相稀释定容刻度，摇匀。该标准工作液1mL含维生素Bi22μg。4仪器、设备
4.1实验室常用设备。
4.2超声波水浴。
4.3高效液相色谱仪，带自动进样器，紫外可调波长检测器。4.4超纯水装置。
4.5离心机：3000r/min。
5试样制备
取具有代表性样品至少500g，用四分法缩分至100g，粉碎，全部过0.28mm孔筛，混勺，装入样品瓶内密闭，避光低温保存备用。国家质量技术监督局1999-08-10批准2000-02-01实施
6分析步骤
6.1提取　
GB/T 17819--1999
6.1.1维生素预混料中维生素Bt2的提取称取试样2~～3g（精确至±0.0001g），置于100mL棕色容量瓶中，加约60mL去离子水，在超声波水浴中超声提取15min，取出，用去离子水定容至刻度，混匀，过滤，滤液过0.45μm滤膜，供高效液相色谱仪分析。
6.1.2维生素Bz制剂(1%～2%)的提取称取试样1g（精确至士0.0001g)于100mL棕色容量瓶中，加入约60mL去离子水，在超声波水浴中超声提取10min，取出用去离子水定容过滤。精确吸取1.00mL溶液于50mL棕色容量瓶中，用去离子水定容至刻度，该液通过0.45m滤膜过滤，供高效液相色谱仪分析。6.2测定步骤
6.2.1色谱条件
柱子:μ-Bondpak NHz,粒度 5 μm,3. 9 mmX 300 mm。柱温：30℃。
流动相：3%正磷酸水溶液260mL与700mL乙腈混合，超声脱气。流速:1.7 mL/min。
检测波长：361nm。
6.2.2定量测定
按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数，用两次以上相应标准工作液，对系统进行校正。将通过0.45um滤膜的样液（6.1.1)依次分装于自动进样小瓶中，依外标法上液相色谱仪测定。6.2.3也可采用反相离子对高效液相色谱测定维生素B12的方法（见附录A）7测定结果的计算
测定结果按式(1)计算：
Pxvxpxv..
P.×m×Vi
式中：-—-每干克样品中维生素B12的含量，mg，m-—试样质量，g；
V.--试样溶液进样体积，uL;
P试样溶液峰面积值；
V-一-试样稀释的体积，mL；
p:--标准溶液浓度，μg/mL，
V.标准溶液进样体积，μL，
户-—标准溶液峰面积平均值。
（１)
每个试样取两份试料进行平行测定，以其算术平均值为测定结果。结果表示到每千克样品中维生素Bi20.01 mg。bZxz.net
8允许差
同-分析者对同一试样同时两次平行测定结果的相对偏差应不大于15%。278
A1原理
CB/T 17819-1999
附录A
（标准的附录）
反相离子对高效液相色谱
测定预混料中维生素B12
试样中维生素B2经水提取后，注入反相色谱柱上，由于输入了有机的反相离子对四丁基磷酸铵(PIC A)和已烷磺酸钠(PIC-B。)溶液，维生素B12的阳离子与移动相中阴离子形成离子偶化合物，在移动过程中与固定相分开达到分离。A2试剂和材料
A2.1甲醇（优级纯）。
A2.2磷酸。
A2.3四丁基磷酸铵（PIC A)。
A2.4已烷磺酸钠(PIC-B.）。
测定色谱条件
柱子：150mmX4.0mm(内径)不锈钢柱。固定相:μ-Bondpak Cis(ODS)粒度 5 μm。移动相：甲醇-水（250+750)约980mL，加入PICA、PICB（各一小瓶）20mL，用上述25%甲醇水定容至1L，混匀，用磷酸调节pH3。流速:1 mL/min。
柱温：室温。
检测器：紫外检测器，使用波长365nm。进样量：20μL。
保留时间：约7.0min。
A4其他各项与正文相同
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