DB43/T697-2012 猪伪狂犬病病毒聚合酶链式反应检测方法 Method of the Polymerase Chain Reaction for the Detection of Porcine Pseudorabies Virus 发布单位：湖南省质量技术监督局 发布日期：2012-07-24 实施日期：2012-12-10 前言 本标准按GB/T1.1-2009的规则编制，由湖南省畜牧水产局提出并归口。标准起草单位：长沙市畜禽水产品质量检验中心，中国动物卫生与流行病学中心。主要起草人：王辉、刘增再、郑姣妹、宁华杰、唐爱明、卢艳芬、陈智、薛爽、吴发兴。 1 范围 本标准规定了猪伪狂犬病病毒聚合酶链式反应（PCR）检测方法。适用于猪组织中猪伪狂犬病病毒基因的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对本文件的应用是必不可少的： GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法（最新版本适用）。 3 术语和定义 3.1 猪伪狂犬病病毒（Porcine Pseudorabies Virus, PRV） 猪伪狂犬病病毒是疱疹病毒科、疱疹病毒亚科的一种病毒。病毒完整粒子呈圆形，直径为150-180nm，核衣壳直径105-110nm，具有膜和纤突。基因组为线状双股DNA。 3.2 猪伪狂犬病（Porcine Pseudorabies, PR） 猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒引起的一种急性传染病。感染猪的临床特征包括体温升高，新生仔猪表现为神经症状，死亡率高。成年猪常为隐性感染，孕期母猪感染可导致流产、死胎及呼吸系统症状。 4 仪器设备和试剂 4.1 仪器设备 4.1.1 移液器 4.1.2 高速离心机 4.1.3 PCR扩增仪 4.1.4 电泳仪 4.1.5 紫外凝胶成像系统 4.1.6 冰箱(-20℃) 4.1.7 研磨器 4.2 常用试剂 本标准所用试剂，除特殊标注外，均为分析纯。实验用水应符合GB/T 6682的规定。试剂配制参见附录A。 4.2.1 PBS缓冲液（pH 7.2） 4.2.2 DNA抽提试剂 4.2.3 PRV引物 4.2.4 灭菌双蒸水（ddH2O） 4.2.5 Taq DNA聚合酶 4.2.6 PCR缓冲液 4.2.7 电泳缓冲液（50倍） 4.2.8 电泳缓冲液（1倍） 4.2.9 1%琼脂糖凝胶 4.2.10 上样缓冲液 4.2.11 75%乙醇 4.2.12 8mM NaOH灭菌水 5 操作程序 5.1 样品的采集和处理 5.1.1 样品采集：采集死猪、扑杀成年猪及流产胎儿的脑、肝、脾、肺等组织病料。 5.1.2 样品处理：每份样品分别处理。取待检病料（1-2g）置研磨器中剪碎并研磨3-4分钟，加入1.0mL PBS缓冲液继续研磨。将研磨后的组织液置1.5mL灭菌离心管中，5000rpm离心10分钟，取上清液提取DNA。 5.2 DNA模板的提取 取出已处理的样品上清液250μL及阴性、阳性对照样品各250μL，加入1.5mL离心管中，每管加入750μL DNAzol Reagent，室温静置3分钟，12000rpm离心10分钟，取上清液800μL，加入500μL无水乙醇，混匀，室温放置5分钟，7500rpm离心5分钟。弃去上清液，沿离心管开口方向滴入1mL 75%乙醇，颠倒混匀，12000rpm离心3分钟，快速弃去上清液，重复洗涤一次，最后将离心管倒扣于吸水纸上，干燥20分钟。取出离心管，用20-30μL NaOH灭菌水溶解，作为模板备用。-20℃保存。 5.3 PCR扩增 每管取ddH2O 7μL，2×GC Buffer I 12.5μL，dNTPs（10mM）2μL，加入待检DNA模板，进行PCR扩增。 附录A 试剂的配制 A.1 PBS缓冲液（pH 7.2） A.2 DNA抽提试剂 A.3 PRV引物 A.4 灭菌双蒸水（ddH2O） A.5 Taq DNA聚合酶 A.6 PCR缓冲液 A.7 电泳缓冲液（50倍） A.8 电泳缓冲液（1倍） A.9 1%琼脂糖凝胶 A.10 上样缓冲液 A.11 75%乙醇 A.12 8mM NaOH灭菌水