DB32/T4000—2021
牛结核病诊断技术（γ-干扰素体外ELISA法）
2021-02-03发布
2021-03-03实施
江苏省市场监督管理局

前言
本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件由扬州大学提出，由江苏省畜牧业标准化技术委员会归口。
本文件起草单位：扬州大学、江苏省动物疫病预防控制中心。
本文件主要起草人：焦新安、陈祥、徐正中、潘志明、陈昌海、股月兰。

1 范围
本文件规定了牛结核病诊断技术（γ-干扰素体外ELISA法）的试剂及仪器、检测方法、质量控制和结果判定等。
本文件适用于牛结核病诊断。

2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 18645 动物结核病诊断技术
GB 19489 实验室生物安全通用要求
GB/T 32945 牛结核病诊断 γ-干扰素体外检测法

3 术语和定义
本文件没有特别需要界定的术语和定义。

4 原理
感染牛分枝杆菌的牛，其T淋巴细胞已被牛分枝杆菌致敏并产生免疫记忆。当体外再次遇到牛分枝杆菌特异性抗原（结核菌素）刺激时，牛外周血中淋巴细胞被激活并大量释放γ-干扰素，而未被感染的牛则不会分泌或低水平分泌γ-干扰素。通过双单克隆抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）检测特异性γ-干扰素浓度水平，即可诊断牛结核病。

5 试剂及仪器
5.1 试剂
外周抗凝血培养所需材料参见附录A。夹心ELISA所需试剂和材料参见附录B。
5.2 仪器
检测所需仪器参见附录C。

6 检测方法
6.1 试剂配制
检测所需试剂的配制见附录D。

6.2 样品采集与处理
6.2.1 无菌采集牛尾静脉血 3mL~4mL，加入至含肝素锂或肝素钠的抗凝血真空管中，轻轻颠倒 2~3 次使血液和抗凝剂混合均匀。室温（22±5℃）运送至实验室并在采血后 24h 内进行培养。
6.2.2 分装前轻轻颠倒抗凝血真空管，充分混匀血液样品。将抗凝血无菌加入至 48 孔细胞培养板，每头牛抗凝血分装 3 孔，1.0mL/孔。
6.2.3 在每头牛的 3 孔抗凝血样品中，分别无菌加入 67μL PBS、67μL 禽型PPD 溶液和 67μL 牛型PPD 溶液，用微量振荡器低速充分振荡，使刺激抗原与抗凝血完全混合。
6.2.4 盖上细胞培养板盖，避免液体挥发。将含有抗凝血和刺激抗原的 48 孔细胞培养板在 37℃ 湿温培养箱中孵育 16h~24h。
6.2.5 使用移液器小心吸取上层血浆 200μL~300μL，转至 1.5mL 离心管中。吸取血浆时应尽量避免吸入红细胞。

表1：48 孔细胞培养板加样示意图
（每头牛分配 3 孔，分别加入 PBS、禽型 PPD 和牛型 PPD 刺激剂）

6.3 酶联免疫吸附试验
6.3.1 溶解阳性、阴性对照冻干粉，配制 1×PBST 洗涤液，按“操作注意事项”平衡其他试剂。
6.3.2 取商品化已包被有 γ-干扰素单克隆抗体的酶标板，先加入 50μL 样品稀释液至各孔中，再加入 50μL 血浆样品及阳性对照、阴性对照至各孔中，轻轻振匀孔中样品，贴上封板膜，37℃ 孵育 2h。
6.3.3 弃去孔内液体。使用 1×PBST 洗涤液洗板 5 次，300μL/孔。每次静置 1min 后弃洗涤液，洗涤完毕后在吸水纸上拍干。