DB32/T2599-2013 畜禽肠出血性大肠杆菌0157:H7的检测 前言 为规范畜禽大肠杆菌0157:H7的检测，特制定本标准。本标准按GB/T 1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》编制，由江苏省农业科学院提出并起草。主要起草人包括张雪寒、何孔旺、叶青、李彬、倪艳秀、温立斌、周俊明、王小敏及俞正玉等。 1 范围 本标准规定了畜禽肠出血性大肠杆菌0157:H7的检测技术，包括细菌分离、血清学鉴定及LAMP方法，用于确诊。ELISA和LAMP方法适用于大批量样品的普查。 2 规范性引用文件 本标准实施依赖的主要文件包括： - GB16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程 - GB/T 4789.36 食品卫生微生物学检验 大肠埃希氏杆菌0157:H7/NM检验 - GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 - NY/T 541 动物疫病实验室检验采样方法 - SN/T 973 进出口肉、肉制品及其他食品中肠出血性大肠杆菌0157:H7检测方法 3 流行病学诊断 肠出血性大肠杆菌0157:H7可感染所有温血动物，通过排泄物污染食物、水源及环境，无症状排菌增加了流行和传播的监控难度。夏季（7-9月）为高排菌季节，人类感染机会增多。 4 临床诊断 在家畜家禽中，牛是主要带菌动物，成年牛通常无症状，特定个体可能出现腹泻。猪可产生水肿病，特征为头部、肠系膜和胃壁浆液性水肿，伴随神经症状，发病率低但致死率高。小鼠死亡后的病理剖检可见肠壁菲薄、透明肿大、出血充血，十二指肠最严重；肝脏灰白色点状坏死；心、肺、脾、肾有点状出血。 5 病原学诊断 5.1 细菌分离 5.1.1 材料准备 所用试剂均为分析纯，水符合GB/T 6682-2008标准。培养基包括含新生霉素肉汤（mEC）、改良麦康凯培养基（CT-SMAC）、改良CHROMagar培养基。 5.1.2 样品采集 用无菌勺子采集新鲜粪便置于无菌培养管。用无菌刮取器从畜禽直肠2-5cm区间刮取肠表皮组织及背部、腹部、臀部表面刮取物，放入无菌培养管。 5.1.3 样品增菌 取粪便或肠组织25g至无菌锥形瓶，加入225mL无菌生理盐水，37℃震荡2小时。取10mL加入90mL含新生霉素EC肉汤（mEC），37℃继续震荡8小时。直肠刮取物或皮肤、羽毛表面刮取物加入10mL mEC，37℃震荡8小时。 5.1.4 全自动酶联荧光免疫分析仪快速筛选 参照GB/T 4789.36-2008“全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法”进行试验，也可使用其他商业化免疫仪器。阳性结果需在CT-SMAC和平板上进一步检测；阴性报告样品中未检测到肠出血性大肠杆菌0157:H7。 5.1.5 免疫磁珠富集与分离 5.1.5.1 取增菌液1mL于无菌EP管。5.1.5.2 加入20uL anti-0157:H7免疫磁珠，颠倒混合后在微量混合器上12rpm混合10分钟。5.1.5.3 放入磁力架静置3分钟，吸走液体。5.1.5.4 用1mL洗脱缓冲液重悬磁珠，反复颠倒混合5-8次，再静置3分钟，吸走多余液体。重复洗涤一次，最后加入50-100uL洗脱缓冲液重悬磁珠。5.1.5.5 将洗脱液涂布于改良麦康凯（CT-SMAC）平板和改良CHROMagar平板进行后续检测。