本标准规定了海洋石油勘探开发作业中使用或生成后排入海洋的部分污染物在不同海区的生物毒性检验中采用的试验方法，以及试验方法中有关样品的处理、试验生物、试验程序、结果判定、质量控制等要求。本标准适用于海洋石油勘探开发作业中使用或生成后排入海洋的钻井泥浆、钻屑和生产水的生物毒性检验。本标准中规定的方法在适当调整试验条件后亦适用于本标准限定外的其他海洋石油勘探开发污染物的生物毒性检验。 GB/T 18420.2-2001 海洋石油勘探开发污染物生物毒性检验方法 GB/T18420.2-2001 标准下载解压密码：www.bzxz.net

GB/T 18420.2--2001
本标准是与GB18420.1
2001《海洋石油勘探开发污染物生物毒性分级》相配套的标准。本标准的附录A、附录B、附录C为标准的附录。本标准的附录D、附录E为提示的附录。本标准由国家海洋局提出并负责解释。本标准由国家海洋标准计量中心归口。本标准起草单位：国家海洋局南海分局、广东省实验动物监测所。本标准起草人：黄韧、杨丰华、吴进孝、薛成、程树军、魏社林、徐梅春。563
中华人民共和国国家标准
海洋石油勘探开发污染物
生物毒性检验方法
Biological toxicity inspection method for pollutant from marinepetroleum exploration and exploitation1范围
GB/T18420.2-—2001
本标准规定了海洋石油勘探开发作业中使用或生成后排海洋的部分污染物在不同海区的生物毒性检验中采用的试验方法，以及试验方法中有关样品的处理、试验生物、试验程序、结果判定、质量控制等要求。
本标准适用于海洋石油勘探开发作业中使用或生成后排人海洋的钻井泥浆、钻屑和生产水的生物毒性检验。
本标准中规定的方法在适当调整试验条件后亦适用于本标准限定外的其他海洋石油勘探开发污染物的生物毒性检验。
2引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB 17378. 3--1998
海洋监测规范第3部分：样品采集、贮存与运输GB17378.4-1998海洋监测规范第4部分：海水分析GB17378.7—1998海洋监测规范第7部分：近海污染生态调查和生物监测GB18420.1—2001海洋石油勘探开发污染物生物毒性分级3定义
本标准采用下列定义
3.1生物毒性检验biological toxicity inspection见GB18420.1—2001。
3.296h换水式生物毒性试验96h renewalbiological toxicitytest在96h的试验期间内每隔一定时间部分更换或全部更换试验溶液，进行观察、测定生物异常或死亡效应的试验。
3.3无可见影响浓度NOEC(no-observed-effectconcentration）指试验生物暴露在一组不同浓度的试验溶液一段时间后，通过观察试验生物的不良影响，并比较试验组与对照组统计分析结果，判定出对试验生物无显著影响的最大浓度。4原理
海洋生物的各种生理活动受海洋环境影响，通过观察测定试验生物在96h试验条件下接触试验物质后的异常或死亡效应，可得到海洋石油勘探开发污染物对试验生物有明显影响的具体浓度。中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2001-08-28批准564
2002-03-01 实施
5采样、送样和样品保存
5.1样品的采集
5.1.1采样数量
GB/T 18420.2-2001
采样数量应足够供3次重复试验的用量。油基泥浆5L，水基泥浆5L，钻屑5kg，生产水排放口采5L。
5.1.2采样地点
5.1.2.1钻井泥浆经振动筛分离后的泥浆应从排放口或泥浆池采集。5.1.2.2钻屑经振动筛分离后采样5.1.2.3生产水在生产水的排放口采样。5.2包装和运输
5.2.1包装
采送样品必须用惰性材料制成的塑料容器密封包装。5.2.2运输
必须符合GB17378.3有关样品贮存与运输的规定，样品必须在48h内送达生物毒性实验室。生产水样品必须在4℃～8℃保存。5.2.3标签
所有样品容器上应标明样品名称、采样油井号、生产或使用者、采样人、采样时间、采样方式、采样数量等。
样品送达实验室后送样人要填写送样表，样品接受人应检查样品标签和包装是否完整，并对样品进行编号、签字和记录存档。
5.2.4贮存
生产水样品必须保存在4C～8℃，其他样品必须保存在阴凉处，并在样品送达实验室后的24h内开始试验。
6试验生物和标准毒物
6.1试验生物
6.1.1种类
下列试验生物只需选用一种。
6.1.1.1对虾仔虾：中国对虾（Penaeus chinensis）、斑节对虾（Penaeus monodon）、长毛对虾(Penaeuspenicillatus).
6.1.1.2卤虫(Artemiidae)幼体。6.1.2试验生物开始试验日龄
6.1.2.1对虾：小于仔虾期10d(P1o期)的仔虾。6.1.2.2卤虫：虫卵孵化20h～24h后的幼体。6.2标准毒物
本试验所用标准毒物为分析纯的十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）。7设施和设备
7.1设施
7.1.1饲养试验生物的水池或水族箱等。7.1.2可控照明装置。
7.1.3维持试验生物的控温、充氧、循环清洁海水的设备，包括制冷和加热的恒温设备、充气设备、循环565
水设备、水过滤设备等。
7.2试验容器
GB/T 18420.2—2001
7.2.1对虾仔虾试验用1000mL烧杯或其他同等体积的玻璃水槽。7.2.2卤虫无节幼体试验用40mL~~50mL的烧杯或其他同等体积的玻璃水槽。7.3环境因子测定的试剂和仪器
7.3.1按GB17378.4第27、30、32章要求的试剂或仪器。7.3.2除7.3.1要求外，可选用的试剂和仪器包括经校正的普通温度计、精密试纸等。7.4其他
搅拌器、显微镜、胶头滴管、量筒、手抄网等。8试验环境和安全注惠事项
8.1试验室环境必须于净、无污染，避免人为的影响因素。8.2试验人员必须作好安全防护措施，如配备工作服，一-次性手套等。9试验程序
9.1试验生物来源、饲养和选择
9.1.1对虾仔虾
9.1.1.1来源从虾苗厂购人或生物毒性实验室自繁饲养9.1.1.2饲养对虾存虾饲养的适宜条件见表1。购人的仔虾必须在实验室驯养48h后才可用于毒性试验，自繁饲养的仔虾必须在试验开始前24h从饲养室移入实验室。表 1仔虾试验室饲养条件
饲养条件
温度，℃
9.1.2卤虫幼体
中国对虾仔虾
9.1.2.1卤虫卵来源从商场购人或实验室自繁收集。斑节对虾仔虾
长毛对虾仔虾
9.1.2.2卤虫卵孵化取1g卤虫卵加人1L稀释水中，在25℃、盐度30～35、光照20001x～30001x的环境条件下充氧孵化，取同一批次孵出的无节幼体放入稀释水中经20h～24h饲养后，选择消化道形成后的幼体用于毒性试验。
9.1.3合格的试验生物
9.1.3.1健康、正常的试验生物，24h内死亡率小于10%。9.1.3.2试验生物的24h标准毒物敏感试验的毒性结果必需与其他批次试验生物的敏感范围致。9.2稀释水的准备
使用人工海水作为稀释水，盐度30.pH(7.9士0.2），溶解氧接近饱和。用作稀释水的人工海水配方必须经试验生物饲养试验，证明其对试验生物的生长发育无明显影响或是已经普遍使用的人工海水配方。
9.3贮备液的配制
9.3.1泥浆贮备液的配制
9.3.1.1油基泥浆按体积比取1份泥浆加入9份稀释水，2000r/min～3000z/min搅拌15h至絮状，然后加水稀释为试验组的最高浓度，继续搅拌5min，静置60min后取上层混悬液作为贮备液9.3.1.2水基泥浆按体积比取1份泥浆加人9份稀释水，2000r/min~3000r/min搅拌15min，然后加水稀释为试验组的最高浓度，继续搅拌5min，静置60min后取上层混悬液作为贮备液。566
9.3.2钻屑贮备液的配置
GB/T 18420.2—2001
9.3.2.1油基泥浆钻屑取一定质量的钻屑加入稀释水中，2000r/min～3000/min搅拌15h，取上层混悬液作为贮备液，试验前充分搅拌。贮备液浓度小于100000mg/L。9.3.2.2水基泥浆钻屑贮备液的准备同水基泥浆。9.3.3生产水贮备液的配制
取一定体积的生产水加人稀释水中，2000r/min搅拌15min，配制成预定浓度的贮备液。9.4预备试验
9.4.1选取4组～5组等比或等间距浓度，如1，10,100，1000mg/L及对照组，设2个~4个重复样，每个容器放5个生物进行试验，以确定全部死亡和存活的浓度范围。温度、PH、溶解氧要求与驯养条件一致，每24h观察记录死亡率，及时取出死亡生物。如试验结果不能确立正式试验液浓度范围则需要重新选择浓度并重复预备试验。
9.4.2在为判定是否符合某个特定毒性容许值的试验中，预备试验浓度可在大于毒性容许值设置等距浓度。
9.5正式试验
9.5.1试验浓度设置
9.5.1.1在预备试验设定的浓度范围内，设定5个等对数间距或等比浓度组和1个对照组，建议采用的等对数间距为1，1.35，1.8，2.4，3.2，4.2,5.6，7.5等及其10的各次方倍数，等比的稀释因子为0.5。如需计算LCsp值，试验浓度应包括无死亡和全部死亡的浓度，用以得到至少三个连续的死亡浓度。每个试验浓度至少4个重复样。每个容器包括10个生物体。9.5.1.2在为判定是否符合某个特定毒性容许值的试验中，如试验生物预备试验的LC5o远大于毒性容许值，则可在大于容许值的区间选择等间距浓度。9.5.2试验生物移人
9.5.2.1对虾仔虾用手抄网在驯养池中随机选择试验生物并及时放入试验容器内。弃用跃出或损伤的生物。在试验操作过程中，应在30min内完成分放试验生物。9.5.2.2卤虫幼体用胶头滴管在驯养容器随机吸取卤虫幼体，然后小心移人试验容器。应在30min内完成分放试验生物。
9.5.3试验溶液更新
每24h准备新的试验溶液，然后从对照组开始，由低浓度到高浓度试验组逐级移入存活的试验生物。
9.5.4充气要求
当试验溶液的溶解氧浓度小于60%的饱和度，必须对试验溶液进行轻微充气，充气气泡为60个/min～100个/min。如试验组进行充气，同样对照组也需进行充气。9.5.5试验的环境因子
试验适宜的环境为温度23C～28C，盐度28～33,pH7.6～~8.2,试验过程中温度变化范围不超过2℃，盐度变化范围不超过2pH值变化范围不超过0.4。9.5.6饲喂
9.5.6.1对虾仔虾喂卤虫无节幼体50个/d，9.5.6.2卤虫幼体饲喂扁藻、小球藻等单细胞藻类，藻液离心后饲喂，应避免加人藻液引起试验溶液体积的明显改变。免费标准bzxz.net
9.5.7观察和记录
每24h观察试验生物两次并记录异常行为，尽快移去试验生物的死亡个体。试验生物存活数记录在原始记录表内，见附录A（标雅的附录）。9.6环境因子的测定和记录
GB/T 18420. 2--2001
每次试验溶液配制后和试验溶液更新前必须测量并记录各项环境因子，如溶解氧、PH值、温度、盐度等。测定方法参照GB17378.4中第27、30、32章的有关规定，另外可选用校正后的普通温度计测定水温以及选用精密试纸测定pH值。测定值记录在96h换水式生物毒性试验原始记录表上，见附录A(标准的附录）。
9.7试验生物死亡判定
试验生物体色变成不透明，轻触无反应或在显微镜下观测心脏停止跳动均可判定为死亡。10试验结果分析和判定
10.1结果的有效性
试验溶液的溶解氧必须达到60%饱和度以上，对照组的死亡率不超过10%，驯养生物24h的LC50和同一实验室其他批次同种生物的试验结果相符。10.2试验结果的判定
生物毒性的试验结果判定见附录C(标准的附录）。10.2.1在大于或等于生物毒性容许值的试验浓度组未出现试验生物死亡，直接判定为大于生物毒性容许值。
10.2.2在小于生物毒性容许值的试验浓度组出现试验生物死亡，对试验结果进行正态分布和方差齐次检验，如符合正态检验和方差齐次检验则采用附录D（提示的附录）的参数检验方法（Dunnett's检验）判定NOEC值。如不符合正态检验或方差齐次检验则采用附录D（提示的附录）的非参数秩检验方法(Steel's多对一检验）判定NOEC值，以NOEC值来判定是否符合生物毒性容许值。10.2.3当小于生物毒性容许值的试验浓度组出现生物死亡，并且有一组的死亡率为100%时，可通过图表法或概率法计算LC5o值。图表法直接判定是否符合生物毒性容许值，概率计算法计算置信区间，以置信上限是否大于毒性容许值为判定限。96hLC5o的概率计算法见附录E（提示的附录）。11质量控制
11.1批间和批内质量控制
11.1.1每批次试验必须同时进行标准毒物的24h生物毒性试验，通过比较LC5值评价试验生物质量的稳定性。
11.1.2保证试验过程试验环境因子的一致性，即试验期间的温度变化不超过2C，盐度变化不超过2，pH变化范围不超过0.4，溶解氧大于60%的饱和度。11.2原始记录
原始记录应完整。包括：采样和试验的时间、地点；样品的保存方法；采样和试验人员签名?试验所用的方法和技术质量控制记录；试验的原始资料，仪器校准和维修记录；试验报告等。12检验报告
检验报告包括检验报告表和试验报告。12.1检验报告表
检验报告表包括：送样单位、送样人、送样时间、样品名称、样品编号、样品接受人、检验依据的标准、试验结果和依据GB18420.1--2001对试验结果判定的结论、出具检验结果的生物毒性试验室签章等。生物毒性检验报告表的格式见附录B(标准的附录)。12.2试验报告
试验报告包括：试验物质的化学性质和其他材料：稀释水，贮备液，和试验溶液的配制：试验动物驯养和负荷数；对照组死亡数和标准物质LCso的生物数据；用浓度反应曲线或方程表示的试验浓度和试验生物反应的关系。
GB/T18420.2
绿活度
（/）
GB/T 18420.2—2001
深日领馆
度一度
（/）
样品接受
生产单位
委托人
来样方式
采样地点
采样方式
样品数量
检验类别
试验生物物种
批准：
GB/T 18420. 2--2001
附录B
(标准的附录）
生物毒性检验报告表
生物毒性检验报告表
产品编号
产品出厂日期
受检单位
委托单位
样品编号
采样日期
样品保存方式
抽样基数
试验日期
试验生物日龄
审核：
检验室：
汇核：
共页第页
(签章）
概率分析
LC re 的计算
96%置葡限
结果判定
死亡率
两组以上死亡
卡方检验
概率计算法
GB/T 18420.2--2001
附录C
（标准的附录）
生物毒性试验结果判定流程图
在小于毒性容许值
试验组生物出现死亡
正态检验
方差齐性检验
Dunnett's 检验
NOEC 值的确定
图 C1试验生物存活的假设检验
两组死亡
最低浓度和最高浓度死
亡为0和100%
Spearman-karber 检验
LC5o和95%置信限
图C2概率分析
结果判定
Stel's 多对一秩检验
图表法求 LC 50 值
改良Spearman
Darber 检验
D1 Dunnett's 检验
D1.1原理和适用范围
GB/T 18420.2—2001
附录D
（提示的附录）
生物毒性试验结果分析举例
Dunnett's检验通过比较各试验组均数和对照组均数来判定两者之间是否有统计学上的差异。本分析方法适用于毒性试验的原始数据符合正态和方差齐次检验后的数据分析。D1.2把一组96h污染物的毒性试验结果的原始数据、反正弦方根变换值、平均值和标准离差列表，见表D1标准差和平均值计算表。
重复样
原始数据
反正弦方根变换
总数T
平均值x
方差平方
对照组
标准差和平均值计算表
建立ANOVA(方差分析）计算表，见表D2。D1.3
表D2ANOVA计算表
变异来源
表中各数值的计算公式为：
自由度
U组间= 3
V组内=8
N-1=11
V组间 1
U组内 N—
离均差平方和SS
SSB=0.681
ssW-0.321
T/n; --- C2/N
IT/n; -C/N
SSW-SSB- SST
SB2 =SSB/(p -- 1)
SW2 =SSW/(N - p)
均方MS=Ss/u
SB3= 0. 227
Sw2=0.040
·(D2)
......( D3 )
...( D4 )
.**.( D5 )
（D6)
.......*..( D7 )
式中：C——表D1计算的总数，
N——样本含量;
一试验组和对照组的总数；
第组。
GB/T 18420.2—2001
D1.4 t值的计算，按式(D8)和表D3 进行。计算t值的公式：
[Sw(1/ni + 1/n,)J1/2
式中，X,——对照组的平均存活率；Xi
-第i试验组的平均存活率；
平均值的方根；
对照组的重复样；
试验组的重复样。
1. 204 -- 1. 111
[0. 020 × (1/3 +1/3)]/ = 0. 570表D3t值计算表
污染物浓度，g/L
..........( D8 )
D1.5方差分析T介值表（见表D4)使用举例。当α=0.05时，查表D4可知t。值为2.42。那么t:<2.42,t4>2.42从而判定NOEC为2.5%。表D4方差分析(Dunnett'stest)T介值表α=0.05单侧检验
D2 Steel's 多对-秩检验 Steel's many-one rank testD2.1原理和适用范围
Steel's检验将各试验组和浓度组编秩后，通过比较各浓度组和对照组的秩和来判定两者之间是否有统计学的差异。本分析方法适用于毒性试验的原始数据不符合正态检验和方差齐次检验后的数据分析。
D2.2分析步骤
D2.2.1把一组96h污染物的毒性试验结果的原始数据、反正弦方根变换值、平均值和标准离差列表：见表D5。
D2.2.2把每个对照组和试验组的数据进行合并；然后将对照组和每个试验组的数据从小到大排序，统一编秩（1，2，）。当数据相同时，秩次取位置序数的平均值；最后把所有排序结果列表，并计算每个试验浓度组的秩和。见表D6秩计算表。574
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