本标准规定了用高效液相色谱仪测定饲料中维生素K3含量的方法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、复合预混合饲料和维生素预混合饲料中维生素K3(亚硫酸氢钠甲萘醌)的测定。测量范围为每千克样品中含维生K3在2.0mg以上。 GB/T 18872-2002 饲料中维生素K3的测定 高效液相色谱法 GB/T18872-2002 标准下载解压密码：www.bzxz.net

1CS.65.120
中华人民共和国国家标准
GB/T18872—2002
饲料中维生素K3的测定
高效液相色谱法
Determination of vitamin K in feeds-High-performanceliguid chromatograph2002-10-31发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2003-04-01实施
中华人民共和国
国家标准
饲料中维生素K，的测定
高效液相色谱法bzxZ.net
GB/T18872-2002
中国标准出版社出版
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2003年3月第一版2003年3月第一次印刷印数1-2000
书号：155066·1-19187
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GB/T18872—2002
本标准在查阅国内外文献的基础上，参考《美国全国饲料协会（NFIA）分析方法概要》发表的方法《高效液相色谱法(HPLC)测定全价饲料、预混料和维生素浓缩制剂中的维生素K。》而制定。本标准在技术内容上参考国外方法，其方法原理、基本操作步骤相同；对范围、称样量、试样提取条件、高效液相色谱测定条件进行了改进，并做了明确规定。本标准的附录A为资料性附录。
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位：国家饲料质量监督检验中心（北京）。本标准主要起草人：陈必芳、赵晓阳。1范围
饲料中维生素K3的测定
高效液相色谱法
本标准规定了用高效液相色谱仪测定饲料中维生素K，含量的方法。GB/T18872—2002
本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、复合预混合饲料和维生素预混合饲料中维生素K，（亚硫酸氢钠甲萘醒）的测定。测量范围为每于克样品中含维生素K，在2.0mg以上。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样方法
3原理
用三氯甲烷氨溶液提取维生素K，并转化成游离甲萘醒，蒸发三氯甲烷，残渣溶解于甲醇中。用高效液相色谱测定，维生素K（甲萘醒）经反相C柱得到分离，紫外检测器检测，外标法计算。若以亚硫酸氧氢钠甲萘醒计需乘以校正系数。4试剂和材料
除非另有规定，仅使用分析纯试剂。4.1水GB/T6682一级用水或相当纯度的超纯水。4.2三氯甲烷。
4.3甲醇，色谱纯。
4.4氢氧化氨25%。
4.5硅藻土（寅式盐）和无水硫酸钠混合物：3十20（按质量）混合。4.6甲萘醒，纯度99.9%（作校准用）。4.7标准溶液：
a）标准贮备液：称取约50mg甲茶醒纯品（4.6）准确至土0.1mg，溶于50mL甲醇（4.3)中，其贮备液浓度为每毫升含甲茶醒1mg，贮于棕色容量瓶中，在≤4C冰箱中保存一周是稳定的。标准工作液：精确吸取甲醒标准贮备液[4.7a)]，用甲醇稀释200倍，使该标准工作液浓度b）
为每毫升含甲萘配5ug。标准工作液当日配制。4.8氮气，99.9%。
5仪器设备
5.1实验室常用仪器设备。
5.2超纯水装置（Millipore或全磨口玻璃蒸馏器）。GB/T18872—2002
5.3旋转振荡器，200r/min。
5.4旋转蒸发器。
5.5离心机，3000r/min。
5.6高效液相色谱仪，带紫外检测器、积分仪、记录仪。6：试样制备
按GB/T14699采样，选取有代表性的饲料样品至少500g，四分法缩减至100g，磨碎，全部通过0.28mm孔径筛，混勾，装人密闭容器中，避光，低温保存备用。7分析步骤
7.1总则
因维生素K，对空气和紫外光具敏感性，而且所用提取剂三氟甲烷氨溶液有异臭，所以全部操作均应避光并在通风厨内进行。
7.2试样溶液的制备
7.2.1称取试样（6）：维生素预混合饲料0.25g~0.5g（精确至0.1mg）或复合预混合饲料1g或浓缩饲料、配合饲料5g（精确至1mg），置人100mL具塞维形瓶中，准确加人50mL三氯甲烷（4.2)放在旋转振荡器（5.3）上旋转振荡2min。加6mL25%氢氧化氨（4.4）旋转振荡3min。再加10g硅藻土和无水硫酸钠混合物（4.5），于旋转振荡器上振荡30min，然后，用中速滤纸过滤（或移入离心管，离心10min)。
7.2.2根据三氟甲烷提取液中甲茶醒的预计浓度（依据样品标示量、称样量和提取液量确定分取量，见附录A），吸取一定量的提取液（7.2.1)移人蒸发瓶中，连接旋转蒸发器（5.4）真空减压浓缩，水浴温度不超过40℃，小心蒸发至体积约为0.5mL，解除真空时通入氮气避免氧化。（或定量吸取三氯甲烷提取液置入小容量瓶内用氮气流吹干）。用甲醇(4.3)或移动相溶解残渣，稀释定容，使其最后溶液浓度为每毫升含甲萘醒1ug～5μg，如果需要可通过0.45um滤膜过滤，供注人HPLC测定。7.3测定
7.3.1高效液相色谱条件
色谱柱：NoVa-pakCig，粒度5μm，长15cm，内径3.9mm，或相当的C柱。流动相：甲醇（4.3）+水（4.1)为750mL+250mL。流速：1mL/min。
温度：室温。
检测器：紫外检测器，使用波长251nm。7.3.2定量测定
按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数和灵度（AUFS)，色谱峰分离R≥1.5。用两次以上相应的标准工作液对系统进行校正，向色谱柱交替注入相应的甲萘醒标准工作液[4.7b]和试样溶液（7.2.2）得到色谱峰面积响应值（PsP），用外标法定量测定。8结果计算
8.1计算公式：饲料中维生素K，的含量，按式1)计算。PxvxnxpxV.xf
式中：
u,--每千克试样中维生素K，的含量，单位为毫克（mg）)；m试样质量，单位为克(g）;
V-提取液的总体积，单位为毫升(mL);提取液稀释倍数：
P——维生素K，（甲萘醒）标准溶液浓度，单位为微克每毫升（ug/mL)；Vat
维生素K：（甲蔡醒）标准溶液进样体积，单位为微升（μL）V:—一从试样溶液（7.2.2)中分取的进样体积，单位为微升(μL)；P与标准溶液进样体积(V.)相应的峰面积响应值；P一—与从试样溶液（7.2.2)中分取的进样体积(V)相应的峰面积响应值，GB/T18872—2002
f校正系数，结果按甲萘醒计时，系数为1以亚硫酸氢钠甲萘醒计时系数为1.9182。平行测定结果用算术平均值表示，保留小数后一位。8.2
9重复性
同一操作者对同一试样同时两次平行测定所得结果相对偏差。每千克试样中维生素K：含量/mg<100
100~1000
相对偏差/（%）
《±20
《±15
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饲料类别
维生素预混合饲料
复合预混合饲料
浓缩饲料
配合饲料
附录A
（资料性附录）
饲料样品标示量、称样量及甲萘提取液稀释度示例表A.1
饲料样品标示量、称样量及甲蒸醒提取液稀释度维生素 K.
标示量
/mg/kg)
20,000
GB/T18872-2002
样品量（m）/g
三氯甲烷体积
(V)/mL
提取液中甲
醒浓度/
(μg/mL)
提取液稀释
倍数(n）
注人HPLC
预计浓度/
(μg/mL)
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