本标准规定了用免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法测定乳和乳粉中的黄曲霉毒素M1，含量。本标准适用于乳、乳粉、以及低脂乳、脱脂乳、低脂乳粉和脱脂乳粉中黄油霉毒素M1，含量的测定，也适用于乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的快速测定。 GB/T 18980-2003 乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法 GB/T18980-2003 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS67.100.10
中华人民共和国国家标准
GB/T 18980--2003
乳和乳粉中黄曲霉毒素M，的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法
Determination of aflatoxin M, content in milk and milk powder--Cleanup by immunoaffinity chromatogaphy and determination byhigh-performance liquid chromatigraphy and fluorometer(ISO14501:1998,IDT)
2003-02-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2003-08-01实施
GB/T18980-2003
本标准的免疫亲和层析净化一高效液相色谱法等同采用1S014501：1998《乳和乳粉中黄曲霉毒素M，免疫亲和层析净化高效液相色谱法》。本标准免疫亲和层析净化一荧光光度法快速测定乳和乳粉中黄曲霉毒素M1。本标准中的附录A为资料性附录。本标准由北京市质量技术监督局提出。本标准由全国食品工业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：北京市产品质量监督检验所、青岛出入境检验检疫局、国家标准物质研究中心。本标准主要起草人：王晶、张鹏、张艺兵、邵明武。本标雄为首次发布。
乳和乳粉中黄曲鑫毒素M，的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法
1免疫亲和层析净化高效液相色谱法1.1范围
GB/T18980—2003
本标准适用于乳、乳粉，以及低脂乳、脱脂乳、低脂乳粉和脱脂乳粉中黄曲霉毒素M含量的测定。乳粉中的最低检测限是0.08μg/kg，乳中的最低检测限是0.008ug/1.。1.2术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。1. 2. 1
黄曲军毒素 M, 含量 aflatoxin M, content通过本标准所测定出的本物质的质量含量。注：黄曲霉毒素Mi的含量以微克/升（μg/L)或微克/千克（ug/kg）表示。1.3原理
试样通过免疫亲和柱时，黄曲霉毒素M，被提取。亲和柱内含有的黄曲篝毒素Mi特异性单克隆抗体交联在固体支持物上，当样品通过亲和柱时，抗体选择性的与黄曲毒素M，（抗原）键合，形成抗体-抗原复合体。用水洗柱除去柱内杂质，然后用洗脱剂洗脱吸附在柱上的黄曲霉毒素M1，收集洗脱液。用带有荧光检测器的高效液相色谱仪测定洗脱液中黄曲霉毒素MI含量。1.4试剂
除非特别声明，所用试剂为分析纯；使用蒸馏水、去离子水或其他相当纯度的水。1.4.1免疫亲和柱：应该含有黄曲霉毒素M,的抗体。亲和柱的最大容量不小于100ng黄曲霉毒素M（相当于50ml浓度为2ug/的试样），当标准溶液含有4ng黄曲霉毒素Mi（相当于50mL浓度为80ng/I.的试样)时回收率不低于80%。应该定期检查亲和柱的柱效和回收率，对于每个批次的亲和柱至少检查次（见1.4.1.1和1.4.1.2）。1.4.1.1柱效检查
用移液管（1.5.4）移取1.0mL的黄曲霉毒素M，储备液（1.4.5.2）到20mL的锥形试管中（1.5.9）。用恒流的氮气（1.4.3)将液体慢慢吹干，然后用10ml.10%的乙睛（1.4.2.2）溶解残渣，用力摇荡。
将该溶液加人到40mL的水中，充分混匀，全部通过免疫亲和柱。按说明书要求使用免疫亲和柱。淋洗免疫亲和柱后，洗脱下黄曲霉毒素M1。将洗脱液进行适当稀释后，用高效液相色谱仪测定免疫亲和柱键合的黄曲霉毒素MI含量。计算黄曲霉毒素M，的回收率，将其结果与1.4.1中所要求的指标进行比较。1.4.1.2回收率检查
用移液管（1.5.4）移取0.8ml.0.005μg/ml的黄曲霉毒素M，标准工作液（1.4.5.3）到10mL的水中，充分混勾，全部通过免疫亲和柱。按说明书使用免疫亲和柱。淋洗免疫亲和柱，洗脱下黄曲霉毒素M1。将洗脱液进行适当稀释后，用高效液相色谱仪测定免疫亲和柱键合的黄曲霉毒素M，含量。计383
GB/T 18980—2003
算黄曲素M，的回收率,将其结果与1.4.1中所要求的指标进行对比。1.4.2乙腈：色谱级。
1.4.2.125%乙-水溶液：将250mL的乙腈（1.4.2）与750mL的水混溶（使用前需要脱气）。1.4.2.210%乙腈-水溶液：将100mL的乙睛（1.4.2）与900mL的水混溶（使用前需要脱气）。1.4.3氮气。
1.4.4三氯甲烷：加人0.5%～1.0%质量比（与三氯甲烷质量比）的乙醇进行稳定。1.4.5黄曲篝毒素M.标准溶液
1.4.5.1校准溶液
黄曲霉毒素M,三氯甲烷溶液标称浓度为10μg/mL。根据下面的方法，在最大吸收波段处测定溶液的吸光度，以确定黄曲霉毒素M1的实际浓度。用分光光度计（1.5.11)在340nm～370nm处测定，扣除三氯甲烷的空白本底，读取标准溶液的吸光度值。在接近360nm最大吸收波段入mx处，测得吸光度值为A，根据式（1）计算出浓度值ci(μg/mL)。
c; =A×M×100/
式中：
A—在入m处测得的吸光度值；
M-—328g/mol,黄曲霉毒素M摩尔质量，单位为克每摩尔（g/mol)；（1)
ε---—1995，溶于三氯甲烷中的黄曲霉毒素Ml的吸光系数，单位为平方米每摩尔（m/mol)。1.4.5.2标准储备液
确定黄曲霉毒素M1标准溶液的实际浓度值后（1.4.5.1），继续用三氯甲烷将其稀释至浓度为0.1ug/mL的储备液。储备液密封后于冰箱中5℃以下避光保存。在此条件下，储备液可以稳定两个月。两个月后，应该对储备液的稳定性进行核查。1.4.5.3黄曲霉毒素M1标准工作液从冰箱中取出储备液（1.4.5.2)放置至室温，移取一定量的储备液进行稀释制备成工作液。工作液当天使用当天制备。
黄曲藓毒素M.标准工作液配制：用移液管(1.5.4)准确移取1.0mL的储备液(1.4.5.2)到20mL的锥形试管中（1.5.9），用和缓的氮气（1.4.3)将溶液吹于，然后用20.0mL10%的乙腈（1.4.2.2)将残渣重新溶解，30min内振摇、混勾，配成浓度为0.005μg/ml的黄曲霉毒素Ml标准工作液。在用氮气对储备液吹于的过程中，一定要仔细操作，不能让温度降低太多而出现结露。在作标准曲线时，黄曲霉毒素M.的进样量分别为0.05ng、0.1ng、0.2ng和0.4ng。根据高效液相色谱仪进样环的容积量，用工作液配制一系列适当浓度的黄曲霉毒素M1标准溶液，稀释液用10%乙腈（1.4.2.2）。
1.5仪器及材料
使用实验室通用仪器设备，特殊仪器及材料说明如下。1. 5. 1次性注射器:10 mL和 50 mL。1.5.2真空系统。
1.5.3离心机：4000g离心力（离心力g=1.12×10-5×转/分×旋转半径）。1.5.4移液管：1.0mL、2.0mL.和50.0ml。1.5.5玻璃烧杯：250mL。
1.5.6容量瓶：100mL。
1.5.7水浴：温控30℃2℃，50℃±2℃，温度范围35℃～37℃。1.5.8滤纸。
1.5.9带刻度的磨口锥形玻璃试管：5mL、10mL、20ml.。1.5.10高效液相色谱仪
1.5.10.1无脉冲泵：适合恒定体积流量约1mL/min的泵。1.5.10.2进样系统：具有固定或可变容积的进样环，进样体积50μl～500μL。GB/T18980—2003
1.5.10.3反相色谱柱：填充3um或者5μm的十八烷基硅胶，加有填充反相材料的保护柱。1.5.10.4荧光检测器：具有365nm激发波长、435nm发射波长，在适当的色谱条件下能够测定0.02ng的黄曲霉毒素M（相当于5倍噪音）。1.5.10.5记录仪：带打印机或绘图仪、电子积分仪或计算机数据处理系统。1.5.11分光光度计：波长范围为200nm~~400nm，带光径长度为1cm的石英比色池。1.5.12天平：准确至0.1g，最小分度0.01g。1.6采样
采样方法不属于本标准叙述的范围，推荐的采样方法请参见ISO707[1]。实验室收到的样品应该具有真正的代表性，在运输和储藏的过程中没有被损坏和改变。1.7分析步骤
1.7.1概述
所有的操作分析均应尽可能在避光条件下进行。使用不同厂商的亲和柱，在乳粉的制作、洗涤和洗脱的操作方面可能略有不同，应该严格按照说明书要求进行操作。通常的分析步骤包括：用水或者盐水缓冲液将乳粉冲制成乳，离心分离后在一定压力过柱（可能需要预洗），用水洗柱，并用甲醇或乙睛洗脱吸附在柱上黄曲霉毒素M1。严格按照规定的流速进行操作。
1.7.2制备试样
1.7.2.1乳
将乳样品在水浴（1.5.7)中加热到35℃~37℃。用滤纸（1.5.8）过滤（根据情况，也许需要用几张滤纸进行过滤），或者在4000g离心力下离心15min。至少收集50mL乳试样，按照1.7.4继续进行分析。
1.7.2.2乳粉
称取10g样品（精确到0.1g），置于250mL的烧杯（1.5.5）中。将50mL已预热到50℃的水多次少量地加人到乳粉中，用搅拌棒将其混合均匀。如果乳粉不能完全溶解，将烧杯在50℃的水浴（1.5.7)中放置至少30min，仔细混匀。将溶解的乳粉冷却至20℃后，移人100ml容量瓶（1.5.6）中，用少量的水分次淋洗烧杯，淋洗液-并移入容量瓶中，再用水定容至刻度。用滤纸（1.5.8）过滤乳，或者在4000g离心力下离心15min。至少收集50mL的乳试样，按照1.7.4继续进行分析。1.7.3免疫亲和柱的准备
将一次性的50mL注射器简（1.5.1）与亲和柱（1.4.1）的顶部相连，再将亲和柱与真空系统（1.5.2）连接起来。
1.7.4样品的提取与纯化
用移液管移取50mL试样（1.7.2.1或1.7.2.2）到50mL注射器（1.5.1）中，调节真空系统（1.5.2），控制试样以2ml./min～3mL/min稳定的流速过柱。取下50mL的注射器，装上10mL注射器。注射器内加人10mL水，以稳定的流速洗柱，然后，抽干亲和柱。
脱开真空系统，装上另一个10mL注射器，加人4mL乙腈（1.4.2）。缓缓推动注射器栓塞，通过柱塞控制流速，洗脱黄曲霉毒素M1，洗脱液收集在锥形管（1.5.9）中，洗脱时间不少于60s。然后用和缓的氮气（1.4.3)在30℃下将洗脱液蒸发至体积V。为50μL～500μL（警告：如果蒸发至干，会损失黄曲囊毒素M,）。用水将V。稀释10倍至最终体积为V，（即500μL～5000μL）。注：如果注人高效液相色谱仪含黄曲霉毒素M，的样品，乙睛含量超过10%，色谱蜂变宽。如果水含量超过90%，则对色谱蜂的形状没有影响。
GB/T 18980---2003
1.7.5高效液相色谱分析仪
1.7.5.1泵
以慎定流速将乙睛-水溶液（1.4.2.1)泵流通过高效液相色谱柱。如果需要（根据所用色谱柱的型号），调整乙腈-水的比例，以保证使黄曲辑毒素M与其他成分的分离效果最佳。乙腈-水溶液（1.4.2.1)的体积流速根据所用色谱柱（1.5.10.3)而定。对于普通色谱柱（柱长约25cm、柱内径约4.6mm）而言，流速在1mL/min左右，效果最好；柱内径为3mm时，流速在0.5ml./min左右，效果最好。
为了确定最佳的色谱条件，最好先将不含黄曲毒素M的阴性样品提取液注人HPIC，然后再注人样品提取液与黄曲霉毒素M，标准溶液的混合液。1.7.5.2色谱性能
标准曲线的线性度和色谱系统的稳定性需要经常检查，多次反复地注人固定量的黄曲霉毒素M标准溶液，直至获得稳定的峰面积和峰高。相邻两次峰面积和峰高的差异不得超过5%。黄曲霉毒素M的保留时间与温度有关，所以对测定系统的漂移需要补偿。每隔一段时间测定固定量的黄曲舞毒素M标准溶液，这些标准溶液的测定结果可以根据漂移的情况进行校正。1.7.5.3黄曲需毒素 M 的标准曲线根据HPLC进样环容积，选择适当体积数V。，分别注人含有0.05ng、0.1ng、0.2ng和0.4ng的黄曲毒素M，标准溶液。绘制成峰面积或峰高对黄曲霉毒素M质量数的标准曲线。1.7.5.4样品洗脱液的色谱分析及进样方案通过进样环将适量体积V，洗脱液注人高效液相色谱仪。采用与标准溶液相同的色谱条件分离出洗脱液中的黄曲毒素M1。标准溶液和样品洗脱液均按照规定的方案进样。当连续检测一系列样品时，建议每隔五个样品，加测一个黄曲毒素M，标准溶液。根据样品洗脱液色谱图中黄曲霉毒素M的峰高或峰面积值，从标准曲线上得出样品洗脱液中所含有的黄曲霉毒素M，质量数（ng）。如果样品洗脱液的黄曲霉毒素M1的峰面积或峰高值高于标准溶液，用水定容稀释样品洗脱液后，重新进样分析。
1.8测定结果的计算与表示
1.8. 1乳
应用式（2)计算被测样品中的黄曲霉毒素M的含量Wm。武中：
Wm = mA X (V//V) X (1/V)
黄曲霉毒素M:的含量，单位为微克每升（μg/I.）；rm
·（2）
mA-样品洗脱液黄曲霉毒素M.的峰面积或峰高从标准曲线上得出的黄曲霉毒素M，的质量数，单位为纳克（ng)；
V…样品洗脱液的体积数，单位为微升（uL）；V-样品洗脱液的最终体积数，单位为微升uL）；V-通过免疫亲和柱被测样品的体积数，单位为毫升（mL）。计算结果表示到小数点后三位。1.8.2乳粉
应用式(3)计算被测样品中的黄曲霉毒素M的含量wp。式中：
wp = mA X(V,/V) ×(1/m)
w--样品中的黄曲霉毒素M,的含量，单位为微克每千克（ug/kg）；m----50mL样液（7.4）中所含有的乳粉质量数，单位为克（g）；386
·（3)
mA、Vt、V:的含义与1.8.1中所定义的-样。式(3)适用于未经稀释的试样，否则应该乘以稀释倍数。计算结果表示到小数点后三位。1.9精密度
GB/T18980—2003
各实验室试验结果的精密度总结于附录A中，这些数据不适用于其他的浓度范围和材质。1.10测试报告
测试报告中应该含有：
a）描述样品完整特征所需要的所有信息；b）采样方法，如果知道请写上；根据该标准，所采用的试验方法；c）
该标准没有提出的其他操作细节，对测试结果可能产生影响的操作、现象以及采取的措施；d)
测试结果；
如果检查了重复性，最终的验证结果。f）
免疫亲和层析净化荧光光度法
2.1范围
本方法规定了用免疫亲和层析净化荧光光度法测定乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的条件和详细分析步骤。
本方法适用于乳和乳粉中黄曲霉毒素M，的快速测定。乳中黄曲霉毒素M.的检出限为0.1μg/L,乳粉中黄曲霉毒素M,的检出限为0.1.uμg/kg。2.2方法要
试样经过离心、脱脂、过滤后，滤液经过含有黄曲霉毒素M特异性单克隆抗体的免疫亲和层析净化，黄曲霉毒素M交联在层析介质中的抗体上。此抗体对黄曲霉毒素M1具有专一性，当样品通过亲和柱时，抗体选择性的与所有存在的黄曲霉毒素M，（抗原）键合。用甲醇-水（10十90)将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇-水（80+20)通过免疫亲和柱洗脱，加人溴溶液衍生后的洗脱液于荧光光度计中测定黄曲体毒素 M,含量。
2.3试剂
除非另有规定，仅使用分析纯试剂、重蒸馏水。甲醇(CH,OH)：色谱纯。
2.3.2氯化钠(NaCI)。
2.3.3甲醇-水（10+90)：取10mL甲醇加人90ml水。2.3.4甲醇-水（80+20）：取80mL甲醇加人20mL水。2.3.5溴溶液储备液（0.01%）：称取适量溴，溶于水后，配成0.01%的储备液，避光保存。2.3.6溴溶液工作液（0.002%）：取10mL0.01%的溴溶液加人40mL水混匀，于棕色瓶中保存备用。现用现配。
2.3.7二水硫酸奎宁(C2。H24NzOz·HzSO4· 2H,O)。2.3.8硫酸溶液（0.05mol/L）：取2.8ml浓硫酸，缓慢加入适量水中，冷却后定容至1000ml。2.3.9荧光光度计校准溶液：称取0.340g硫酸奎宁（C2H24NzOz·HzSO.·2HzO），用0.05mol/L硫酸溶液溶解并定容至100mL，此溶液荧光光度计读数相当于2.0ug/L黄曲霉毒素M1标准溶液。0.05mol/1.硫酸溶液荧光光度计读数相当于0.0μg/L黄曲霉毒素M。2.4仪器
2.4.1荧光光度计。
2.4.2离心机：离心力不低于4000r/min。387
GB/T 18980--2003
玻璃纤维滤纸：直径11cm，孔径1.5μm。2.4.3
黄曲霉毒素M，免疫亲和柱。
空气压力泵。
玻璃试管：直径12mm，长75mm，无荧光特性。2.4.6
玻璃注射器。
2.5分析步骤
2.5.1样品提取
2.5.1.1乳
取50mL乳样品，加入1.0g氯化钠，4000r/min离心力下离心10min，小心移取用于分析的乳底层脱脂部分，不要扰动顶部脂肪层，将脱脂的乳以玻璃纤维滤纸过滤，滤液备用。2.5.1.2乳粉
称取5.0g乳粉，用30℃～60℃水将其慢慢溶解，定容为50mL，加入1.0g氯化钠，以下按2.5.1.1的步骤操作。
2.5.2净化
将免疫亲和柱连接于10mL玻璃注射器下。准确移取10.0mL上述滤液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与注射器连接，调节压力使溶液以约6mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2mL~3mL空气通过柱体。以10mL甲醇-水(10十90)清洗柱子两次，弃去全部流出液，并使2mL~~3mL空气通过柱体。准确加人1.0mL(V,)甲醇-水(80+20)洗脱液洗脱，流速为1 mL/min～2mL/min，收集全部甲醇-水洗脱液于玻璃试管中，备用。2.5.3测定
2.5.3.1荧光光度计校准
在激发波长360nm，发射波长450nm条件下，以0.05mol/L硫酸溶液为空白，调节荧光光度计的读数值为0.0μg/L；以荧光光度计校准溶液调节荧光光度计的读数值为2.0μg/L。2.5.3.2样液测定
取上述洗脱液加入1.0mL(V)0.002%溴溶液，1min后立即于荧光光度计测定样液中黄曲霉毒素M 含量 c。
2.5.3.3空白试验
用水代替试样，按2.5.1～2.5.3步骤做空白试验。2. 6 结果计算
乳检测结果按式（4)计算：
Xi = (c1 - co) ×Vi×10
式中：
X,-试样中黄曲霖毒素M含量，单位为微克每升（μg/L)；-荧光光度计中读取的样液中黄曲霉毒素M,的浓度，单位为微克每升（μg/L)；G
—荧光光度计中读取的空白试验中黄曲霉毒素M，的浓度，单位为微克每升（μg/L)；Co -
Vi-—最终净化甲醇-水洗脱液体积，单位为毫升(mL)；V一通过亲和柱试样体积，单位为毫升（mL）；10—--仪器的读数系数。
计算结果表示到小数点后一位。388
2.6.2乳粉
乳粉检测结果按式(5)计算：
式中：
X, - (c2 -co)XVi×10
GB/T 18980-2003
X2-—-试样中黄曲霉毒素M1含量，单位为微克每千克（μg/kg）；-荧光光度计中读取的样液中黄曲赛毒素M,的浓度，单位为微克每升（μg/L)；C2
Co-—-荧光光度计中读取的空白试验中黄曲霉毒素Mi的浓度，单位为微克每升（μg/L);V,-—最终净化甲醇-水洗脱液体积，单位为毫升(mL)；V---通过亲和柱试样体积，单位为毫升(mL）；m
-50mL试样中所含乳粉的质量数，单位为克每毫升（g/mL）；10———仪器的读数系数。
计算结果表示到小数点后位。
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附录A
（资料性附录）
多个不同实验室的试验结果
世界各地16个实验室参加了低脂肪（1%）和高脂肪（28%）乳粉样品的协同试验。高脂肪样品是用于制作参比物质的剩留物[4],所以黄曲霉毒素M1的含量是已知的。对于乳粉，其污染水平为0.08μg/kg~0.6μg/kg，即对于乳而言，污染水平为8ng/L~60ng/L.。试验结果根据ISO5725-1和IS05725-2/2：3规定的统计方法获得，其精密度的数据列于表A1（注：试验数据来自于参考文献[5]和[6]。表A1
精密度数据
样品编号
实验室个数”
平均值/（ng/kg）
重复性值r/（ng/kg）
再现性值R/（ng/kg）
重复性变异系数/(%)
复验性变异系数/（%）
减少的实验室数是根据Cochran和Grubbs统计方法应该从样本中剔除的数据。390
参考文献
[1] ISO 707:1997,Milk and milk products---Guidance on sampling.GB/T18980---2003
[2J IS0) 5725-1:1994,Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results--PartI :General principles and definitions.[3J ISO 5725-2:1994,Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results --Part2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measure-ment method.Www.bzxZ.net
[4J Commission of the European Community. Community Bureau of Reference, BCR. The certification of aflatoxin M, in three milk powder samples,CRM No. 282,284.285. Van Egmond H. Pand Wagstaffe P. I. ,Report and Addendum report ,EUR 10412,1986.[5J IDF collaborative study on the determination of aflatoxin M, in milk powder,using immunoaffinity columns,L. G. M. T, Tuinstra,Roos A. H><.AND Van Trijp J. M. P. ,RIKILT Report,92,1992.p.14.
L6J Liquid chromatographic determination of aflatoxin M, in milk powder using immunoaffinity col-umns for cleanup:Interlaboratory study. Tuinstra I. G. M. t. ,Roos A. H. and van Trijp JM>P、J.A.O.A.C.Int.,1993,76(6)pp.1248-1254.391
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