ICS 65.020.01 B40 DB37 山东省地方标准 DB37/T 3754—2019 动物产品中马、驴、骡源性成分的定性检测方法 实时荧光PCR法 Qualitative detection of horse, donkey and mule derived materials in feed and relative products — Real-time PCR method 2019-12-05发布 山东省市场监督管理局 发布 2020-01-05实施 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009的规则起草。本标准由山东省市场监督管理局提出、归口并组织实施。 本标准起草单位：山东省产品质量检验研究院、青岛朗天科技服务有限公司、中国人民解放军疾病预防控制中心。 本标准主要起草人：王一村、都丹、李娜、高静静、侯广月、周莉莉、许士明、张灿、徐正、才美佳、赵彤彤、张宇鑫、王诚、康兆广、苏本玉、邹惠玲、张鹏。 本标准为首次发布。 引言 目前动物相关产品中骡源性成分检测尚无国家标准及行业标准，且现有基于实时定量PCR技术的驴、马源性成分检测无法排除骡源性成分干扰。本标准主要适用于动物原材料及动物相关产品的检测，不适用于动物深加工产品（如阿胶及其附属产品）的检测。 1 范围 本标准规定了动物原材料及动物相关产品中马、驴、骡源性成分的定性检测方法。 本标准适用于动物原材料及动物相关产品的定性检测，不适用于动物深加工产品（如阿胶及其附属产品）的检测。本方法最低检出限（LOD）为100 mg/kg。 2 规范性引用文件 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 SN/T 1193 基因检测实验室技术要求 3 术语和定义 3.1 荧光定量PCR技术 在PCR指数扩增过程中，通过连续监测荧光信号变化实时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因初始量的方法。 3.2 Ct值 每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。 3.3 已知来源于单一动物源性成分的样品 肉眼可判断来自同一生物有机体的样品，或有证据表明来源于同一种生物有机体且未受其他源性成分干扰的样品。 4 原理 骡为马与驴杂交后代，含有马和驴的核基因双重遗传背景。利用TaqMan实时荧光PCR技术，根据动物核基因组中编码肌肉肌酸激酶（CKM）基因在不同物种间序列差异进行动物源性成分鉴定。 提取高纯度DNA后，以其为模板进行内参照基因实时荧光PCR检测，以判断DNA提取效率及PCR体系是否满足要求。 通过特异性引物及荧光标记探针进行马、驴、骡源性成分扩增，根据荧光信号变化实现定性分析： - 检出马信号且无驴信号：含马成分； - 检出驴信号且无马信号：含驴成分； - 同时检出马和驴信号且样品为单一来源：判定含骡成分。 5 仪器和设备 5.1 电子天平（感量0.01 g） 5.2 微量可调移液器（10 μL、20 μL、100 μL、1000 μL） 5.3 恒温水浴锅 5.4 磁力搅拌器 5.5 高速冷冻离心机 5.6 二级生物安全柜 5.7 高压灭菌锅 5.8 冰箱（4℃、-20℃） 5.9 pH计 5.10 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计 5.11 实时荧光定量PCR仪 6 试剂和材料 6.1 试剂配制及操作规范按GB/T 27403和SN/T 1193执行 6.2 试剂为分析纯或化学纯，实验用水符合GB/T 6682要求 6.3 检测用引物和TaqMan探针序列见表1