本标准规定用高效液相色谱测定普通的和脱咖啡因的生咖啡和焙炒咖啡豆，以及普通的和脱咖啡因的咖啡抽提粉中的咖啡因含量的一种方法。 GB/T 19182-2003 咖啡 咖啡因含量的测定 高效液相色谱法 GB/T19182-2003 标准下载解压密码：www.bzxz.net

GB/T 19182--2003/ISO 10095:1992本标准等同采用国际标准1SO10095：1992《咖啡—咖啡因含量的测定高效液相色谱法》。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由农业部热带作物及制品标准化技术委员会归口。本标准起草单位：华南热带农产品加工设计研究所。本标准主要起草人：黄和、程雪梅、叶英本标准为首次发布。
1范图
GB/T 19182--2003/IS0 10095: 1992咖啡咖啡因含量的测定
高效液相色谱法
本标准规定用高效液相色谱测定普通的和脱咖啡因的生咖啡和焙炒咖啡豆，以及普通的和脱咖啡因的咖排抽提粉中的咖啡因含量的种方法。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡题不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。1SO1447：1978生咖啡一一水分含量的测定（常规法）ISO3726：1983速溶咖啡——-在70℃减压条件下减重的测定ISO4072袋装咖啡取样
ISO6670衬里箱装速溶咖啡取样
1SO6673：1983生咖啡—在105℃下减重的測定3原理
将试料放人水中，加热至90℃，在有氧化镁存在的条件下，抽提潮排因并过滤，然后用苯基改性二氧化硅微柱将全部抽提液纯化。使用配有紫外检测器的高效液相色谱仪测定其咖啡因含量。4试剂bZxz.net
除非另有规定，只使用确认的分析级试剂，以及蒸馏水或脱矿物质水或与之等效纯度的水。4.1甲醇，液相色谱级。
4.2氨溶液（0.3mo1/1）*甲醇，90*10体积混合液，4.3洗提溶剂，纯化柱用，甲醇；水乙酸，75：251体积混合液。4.4流动相，甲醇：水*30：70体积混合液。取600mL甲醇（4.1)倒人2L单标容量瓶内，加水至刻度，混合后混合液用孔经为0.45μm过滤器过滤。
4.5乙醇：水，1：4体积混合液。4.6氧化镁。
4.7咖排因储备液：样当于每升含0.5g咖啡因溶液。称取125-m签咖啡因，精确至0.1mg，放人250mL棕色玻璃容量瓶内，并用乙醇：水（4.5）加至半满，咖啡因溶解后，再加相同的乙醇：水混合液到刻度。
该溶液在冰箱内可保存一个月。4.8咖啡因标准溶液A，相当于每升含0.010g咖啡因，用于脱咖啡因的产品。将储备液（4.7)加温至室温后，用吸移管（5.12)吸取2mL移人100mL单标容量瓶内，用水补充至刻度并摇句。
该溶液于当日配制使用。
GB/T 19182-2003/ISO 10095 : 19924.9咖啡因标准溶液B，相当于每升含0.05咖啡因，用于普通的产品。将储备液（4.7)加热至室温后，用吸移管（5.12)吸取5mL移入50mL.单标容量瓶内，并用水补充至刻度并摇勾。
5仪器
普通实验室仪器，特别是下列各项。5.1高效液相色谱仪，配有紫外检测器，允许使用的波长在254nm至280nm之间。装有-台带刻度记录纸的记录仪。测定时最好选择接近280nm处，因为咖啡因最大吸收波长是在272nm。5.2高效液相色谱用的色谱柱C18型，最好是微球粒，并至少具有5000个理论塔板数的性能。条柱的理论塔板数N，可以根据注人纯咖啡因标准溶液，而得到的峰形进行如下计算。Nm5.54
式中；
t峰的保留时间；
半峰宽度。
+++**营象营抑( 1 )
5.3纯化柱，用于反相色层（分离）法，柱的容量3美L，是用于微粒平均大小为40苯基改性的二氧化硅填充。
注：在反相层析中，用苯基改性的3mLBakerSPE柱是一种可在市场买到的适用产品，这是给使用本国际标准的人员提供方便的信息。而不是国际标准化组织对这产品的认可。5.4咖啡磨，适用于磨碎焙炒的咖啡豆。5.5嵌齿轮磨，装有冷却套；或者分析磨、装有刀片和冷却套；或者其他适于磨碎生咖啡豆的磨。5.6筛，用金属材料织成，其孔径大小为630以m。5.7过滤器，其微孔大小为0.45um。5.8水浴锅，能在90℃士1℃温度下连续搅拌工作。5.9分析天平，能称量精确至0.0001g。5.10螺旋盖瓶子，容量为250mL试剂瓶。5.11单标容量瓶，容量为10ml50mL、100mL.250ml和2L5.12吸移管，容量为2.0ml5.0ml、10.0mL。6取样
袋装咖啡取样按ISO4072执行。
衬里箱装速溶咖啡取样按ISO6670执行。7试样的制备
若有必要，用5.4或5.5所规定的设备研磨，直至试样能通过（5.6)所述的筛网为止。8操作程序
8.1物质含量的测定
测定一部分试样中的水分含量，用于计算干物质的含量，并按下列方法进行。ISO1447或ISO6673，用手生咖啡。ISO3726用于速溶咖啡。
对于其他类别的咖啡以及从咖啡衍生的产品，将按未来的国际标准执行。8.2试料
GB/T 19182--2003/IS0 10095: 19928.2.1警通的和脱咖啡因的生咖啡或焙炒咖啡：称敢这种试样1g，精确至0.000138.2.2普通的和脱咖啡因的速溶咖啡粉；称取这种试样0.5g，精确至0.0001g。8.3咖啡因的提取
8.3.1把试料（8.2.1或8.2.2)放人250mL的瓶中（5.10），加人氧化镁4g土0.5g以及水100，称瓶和内盛物的质量，精确至0.1g。8.3.2盖好瓶子，摇匀内盛物，把瓶和内盛物置于90℃水浴上继续搅拌20min。冷却瓶子及内感物，再次称量，精确至0.1多。其质量应等于8.3.1所测定的质量。8.3.3若质量不致，取另一试料按（8.3.1和8.3.2)另一次提取。8.3.4将溶液静置，转移部分溶液并用过滤器（5.7)过滤。8.4溶液的提纯
在溶液发生任何分离前，需准备好纯化桂（5.3）。8.4.1纯化柱的制备
装配纯化柱如图1所示。
打开活塞，用5m1甲醇（4.1）洗涤柱子，其时需调节活塞，使其达到滴注，当在二氧化硅面保持有1mm~2mm甲醇时，关闭活塞。加水5mL，再次打开活塞，而当二氧化硅面保持有1mm2mm水时，再次关闭活塞。
不允许柱干凋，否则需重做。
1 m注射器;
2柱；
3-用苯基改性的…氧化硅，
4- 1 mm～2 mm甲醇 水;
5-活塞打开或活塞关闭。
图1纯化柱的制备
8.4.2咖啡固的吸收
用移管吸取溶液至柱中，选择方法有两种：a）对于普通咖啡或咖啡提取物，吸取从8.3.4获得的滤液2.0mL。3
GB/T 19182-2003/ISO 10095:1992b）对于脱咖啡因咖啡或脱咖啡因的咖啡提取物，吸取从8.3.4获得的滤液10.0mL。调节活塞，使溶液滴注，在液面刚降至低于二氧化硅面时关上活塞。8.4.3脱除不需要的化合物
首先打开活塞，加人2.5mL氨溶液：甲醇的混合液（4.2），在液面刚刚降低于二氧化硅面时，关上活塞。再次加入2.5mI.混合液（4.2），使其完全流过柱。然后吹人约30mL空气通过柱子，以便尽可能多地脱除混合液（4.2）。
注：在这个阶段的操作程序中，柱可能变戒干游。8.4.4咖啡因的洗提
将10mL单标容量瓶置于柱的下端，打开活塞而且加人7.5mL(4.3）洗提溶剂，调节活塞使之滴注，让洗提溶剂完全流人容量瓶，用水加至刻度并摇勾内盛物。8.5高效液相色谱分析
8.5.1仪器的调整
装配好色谱仪（5.1），按以下条件进行调整：按所使用的柱（见5.2)调流动相（4.4)的流速在0.5mL/min至1.5mL/min之间，柱（5.2)的温度在40℃
注：通过并高柱温世能改警蜂值分离效集，不能超过608.5.2分析
在流动相（4.4)的流速和柱温稳定后，将从8.4.4所得的试液10μL注入柱中，而后以等体积标准咖啡因溶液（4.8或4.9)注人柱中。注：常规1er法卿，可以满是咖啡因的浓度大到0.025g/L，这个水平高于用本试验方法的咖啡因浓度，但这不会导致仪器的偏差，光度与咖啡因浓度校准曲线。9结果的囊示
样品中咖啡因含量以每100g干物质所含的克数表示：9.1用于普通焙炒咖啡、生咖啡或速溶咖啡粉：会×c×2×m×1000
式中：
A.从试液中得到的咖啡因峰的面积，10 X 100
A从标准咖啡因溶液中得到的咖啡因峰的面积，100×100
C1—标准咖啡因溶液的浓度（4.9），单位为克每升（g/L）试料的质量，单位为克（g）；
R，----试样（见8.1）干物质含量的质量百分率。9.2用于脱咖啡因的焙炒咖啡或生咖啡或咖啡粉：×ca×10xx00×
式中·
10 ×100
100×100
C2—标准咖啡因溶液的浓度（4.8），单位为克每升（g/L）。10精密度
10.1重蔓性
·（2)
（3）
在短期内，用相同的设备、相同的操作人员，并在同一实验室，用完全相同的试验材料进行试验，获得的两个单独试验的结果绝对误差，应不超过表1所列的数值。4
焙炒咖啡豆
脱咖排医的
焰炒瓣啡豆
速溶咖啡
脱嘟啡因的
速落咖啡
10.2薄现性
重复性和再现性
咖因含量/（g/100）
GB/T 19182—2003/IS0 10095:1992重复性/（名咖啡因/100g咖啡）再现性/（这咖啡因/100g咖啡）0.07
用不同的设备、不同的操作人员，在不同的实验室，对完全相同的试验材料，以相同的方法进行试验，获得的两个单独试验的结果绝对误差，应不超过表1所列数值。试验报告
试验报告至少应给出以下儿个方的内容：试样；
使用的标准（包括发布或出版年号）；使用的方法（如果标准中包括几个方法）；结果，包括涉及“结果计算”的内容，与基本分析步骤的差异，
观察到的异常现象；
一试验日期。
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