DB32/T2447—2013 江苏省地方标准 马立克氏病病毒感染的间接免疫荧光诊断技术操作规程（IFA诊断技术） 前言 本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》的要求编制。本标准由扬州大学提出，由扬州大学兽医学院起草。本标准主要起草人：金文杰、秦爱建、崔治中、殷俊、张鑫宇、刘岳龙、邵红霞。 1 范围 本标准规定了马立克氏病病毒感染的间接免疫荧光诊断技术中外周血液单核细胞（PBMCs）的制备方法，以及利用特异性抗体对待检PBMCs进行间接免疫荧光检测以判定病毒感染情况的方法。 2 规范性引用文件 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 外周血液单核细胞（PBMCs）的制备 3.1 待检样品采集 按照抗凝剂与血液1:9比例采集新鲜抗凝血，采集18日龄以上待检家禽血液。抗凝剂配制见附录A。 3.2 PBMCs制备方法 将抗凝血缓慢加入含有淋巴细胞分层液的试管中，使血液层覆盖在分层液上，使用水平转子离心机以2000r/min离心30分钟。吸取PBMCs层置于离心管中，用PBS（pH7.2，0.01mol/L，配制见附录B）以1000r/min离心10分钟洗涤1～2次，最终用PBS配制成细胞悬液（约10⁶个/mL）。 4 间接免疫荧光检测待检PBMCs感染病毒 4.1 抗MDV特异性抗体 作为第一抗体，采用抗MDV gB单克隆抗体BA4和BD8（扬州大学江苏省动物预防医学重点实验室制备保存）。 4.2 FITC标记抗体 第二抗体采用市售FITC标记的抗小鼠IgG山羊抗体。 4.3 悬浮法间接免疫荧光操作步骤 a）在1.5mL离心管中加入100μL单细胞悬液，再加入100μL第一抗体，混匀后于37℃作用45分钟； b）加入1mL PBS重悬细胞，以1000r/min离心5分钟洗涤，重复1次； c）加入100μL PBS重悬后再加入100μL FITC标记抗体，37℃孵育45分钟； d）再次用PBS洗涤2次，最后一次离心弃上清； e）用20～30μL含10%甘油PBS重悬细胞，滴加载玻片，加盖玻片封片后立即用倒置荧光显微镜观察。 4.4 结果判定 感染MDV的PBMCs细胞内呈黄绿色荧光，未感染细胞不着色或颜色极淡。在200×或400×显微镜下，可见感染细胞核明显荧光，而未感染细胞仅显示轮廓。 附录A（规范性附录）抗凝剂的配制 肝素溶液：用生理盐水将肝素粉配制成200单位/mL储存备用。采血时抗凝终浓度为15～20单位/mL。