ICS 65.020.01 B40 DB37/T 3533—2019 山东省地方标准 驴、骡、马皮张源性成分鉴定 实时荧光定性PCR法 Identification of donkey, mule/hinny and horse derived materials in leather — Real-time fluorescent PCR method 发布：2019-03-21 实施：2019-04-21 发布单位：山东省市场监督管理局 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施，由山东省畜牧专业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省农业科学院生物技术研究中心、山东东阿国胶堂阿胶药业有限公司、山东宏济堂制药集团股份有限公司、济南张景牧业科技发展有限公司。 本标准主要起草人：张全芳、胡悦、范阳阳、刘艳艳、董书光、徐慧敏、孟朝红、余彩娟、耿加亮、郝大魁、张同清、谭晴晴、步迅、陈淑娟。 1 范围 本标准规定了驴、骡和马三种动物皮张源性成分的实时荧光定性PCR检测方法。 本标准适用于动物皮张及其初加工产品中驴、骡和马源性成分的定性检测。本方法检出限为0.5%。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 3.1 实时荧光PCR（real-time fluorescence PCR） 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR过程，对未知模板进行定性或定量分析。 3.2 Ct值（cycle threshold） 每个实时荧光PCR反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。 4 原理 以核基因cKM（creatine kinase of muscle）为靶基因，设计动物通用引物以及驴和马的特异性探针，采用TaqMan实时荧光PCR技术进行扩增。根据PCR扩增过程中的荧光信号变化及循环阈值（Ct值），判定样品中是否含有驴、马及骡源性成分。 5 试剂或材料 除另有规定外，分析中仅使用确认为分析纯的试剂及符合GB/T 6682规定的一级水。 5.1 试剂 5.1.1 氯化钠（NaCl） 5.1.2 浓盐酸（HCl） 5.1.3 三羟甲基氨基甲烷（Tris base） 5.1.4 二水乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA·2H2O） 5.1.5 十二烷基硫酸钠（SDS） 5.1.6 蛋白酶（冻干品） 5.1.7 异硫氰酸胍（GuSCN） 5.1.8 硅珠 5.1.9 无水乙醇 5.2 材料 5.2.1 驴、骡和马皮张源性成分实时荧光PCR定性检测试剂盒 5.2.2 2×TaqMan Master Mix：含Taq DNA聚合酶（终浓度1 U/20 μL）、Mg2+（终浓度2.0 mmol/L）、dNTPs（终浓度0.2 mmol/L） 5.3 溶液配制 5.3.1 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）溶液：称取12.1 g Tris置于烧杯中，加入约80 mL水，用浓盐酸调节pH至8.0，转移至100 mL容量瓶，加水定容。于121℃（103.4 kPa）灭菌20 min，室温保存。 5.3.2 1 mol/L Tris-HCl（pH 6.4）溶液：称取12.1 g Tris置于烧杯中，加入约80 mL水，用浓盐酸调节pH至6.4，转移至100 mL容量瓶，加水定容。于121℃灭菌20 min，室温保存。 5.3.3 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）溶液：称取18.61 g二水乙二胺四乙酸二钠溶解于水中，调节pH至8.0后定容并灭菌保存。 6 仪器设备 （原文未完整提供，内容保留结构） 7 检测用引物和探针 （原文未完整提供，内容保留结构） 8 试验步骤 8.1 样本制备 8.2 DNA提取 8.3 实时荧光PCR反应 9 试验数据处理 9.1 PCR有效性判定 9.2 检测结果分析和表述 10 检测过程中防止交叉污染的措施 （原文未完整提供，内容保留结构） 附录A（规范性附录） 实时荧光定性PCR引物/探针序列、反应体系及结果判定 附录B（资料性附录） 目的基因扩增靶标参考序列