DB34/T824—2020 (代替DB34/T824-2008)
动物组织中盐酸克伦特罗的残留测定 胶体金免疫层析法
Determination of clenbuterol hydrochloride residue in animal tissues - Colloidal gold immunochromatographic method
发布日期：2020-08-03
实施日期：2020-09-03
发布单位：安徽省市场监督管理局

前言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。DB34/T824-2020代替DB34/T824-2008《动物组织中盐酸克伦特罗的残留测定—胶体金免疫层析法》，除编辑性修改外主要技术变化如下：
一、修改了标准名称，删除了标准名称中的连接符；
二、修改了试剂和材料内容（见第4章）；
三、增加了仪器设备（见第5章）；
四、修改“实验步骤”为“检测步骤”，并修改了部分内容，优化了样品制备（见第6章）；
五、修改了结果判断内容，“方法确认”改为“有效性确认”（见第7章）；
六、修改结果确认方法表述（见第8章）；
七、增加了附录A（见附录A）。
本标准由安徽省兽药饲料监察所提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽省兽药饲料监察所、宁国市金东坊农业开发有限公司、合肥谱尼测试科技有限公司、望江县畜牧兽医局、合肥市动物疫病预防与控制中心、合肥市动物卫生监督所、宁国市自然资源和规划局、安徽省水产技术推广总站、铜陵市义安区畜牧兽医局。本标准主要起草人：许世富、吴昊、赵家喜、司宏富、何广、徐勇、许晓靖、孙德祥、何为俊、胡林林、王振。

1 范围
本标准规定了动物肌肉、肝脏、肾脏中盐酸克伦特罗残留测定的胶体金免疫层析法。本标准适用于动物肌肉、肝脏、肾脏中盐酸克伦特罗残留的快速检测。本标准检测限为3μg/kg。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

3 原理
本方法采用胶体金竞争抑制法。将氯金酸用枸橼酸钠还原法制成一定直径的金溶胶颗粒，标记抗体。硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细管作用，将样本滴加在胶体金检测条样品垫一端，使液体慢慢向吸水纸另一端渗移。在样本移动的过程中，会发生相应的抗原抗体反应，并通过免疫金的颜色而显示出来。样本中的克伦特罗在流动的过程中与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和硝酸纤维素（NC）膜检测线上的克伦特罗人工抗原的结合，使检测线不显颜色，结果为阳性；反之，检测线显紫红色，结果为阴性。

4 试剂和材料
4.1 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的二级水。
4.2 胶体金免疫层析快速检测卡组成：
4.2.1 盐酸克伦特罗特异性抗体。
4.2.2 胶体金。胶体金溶液采用氯金酸还原法制备，应为带负电的紫红色疏水胶体金溶液，金颗粒大小应在30nm~60nm之间。
4.2.3 硝酸纤维素膜。硝酸纤维素膜表面应平整、光滑、洁净，无划痕、凹印、小孔、水迹、橘皮状或其他肉眼能见的瑕疵，无灰尘、油渍或其他杂物。硝酸纤维素膜宽度为25.4±0.5mm，长度在100±2mm，厚度在185±19μm，毛细流速为180±45s/40mm。
4.2.4 聚酯纤维膜。聚酯纤维膜表面形状应为基本均匀的矩形，无明显歪斜现象。色泽好，白色，表面洁净，均匀度好，无破损，无起皱，无污点，无色斑，无霉点，无异味，无杂质。聚酯纤维膜重量在98.3±10.0g/m²，厚度为0.42±0.07mm，长度为305.0±2.5mm，宽度为254.0±2.5mm。
4.2.5 吸水纸。
4.2.6 底板。
4.2.7 塑料盒。
4.2.8 塑料吸管。
4.2.9 金标样品稀释液。
4.3 阴性对照：取不含盐酸克伦特罗的空白样品，作为空白试料。
4.4 阳性对照：取盐酸克伦特罗标准工作液用水稀释为10μg/L。
4.5 盐酸克伦特罗标准品。

5 仪器设备
5.1 电子天平：感量分别为0.01mg和1mg。
5.2 离心机：≥3000rpm。
5.3 水浴锅。

6 检测步骤
6.1 样品制备
取新鲜或解冻后的供试样品适量（约1g），剪碎，装入3mL离心管中，盖紧管盖，100℃加热5min，取出，自然冷却，3000rpm离心5min，取上清组织渗出液100μL，加入100μL金标样品稀释液（4.2.9），混匀，备用。
6.2 溶液制备
6.2.1 盐酸克伦特罗储备液
准确称取盐酸克伦特罗标准品适量，用甲醇溶解后稀释成1mg/mL的储备液，于-18℃冰箱中贮存备用，有效期3个月。
6.2.2 盐酸克伦特罗标准工作液
取盐酸克伦特罗储备液，用水稀释至100μg/L，于4℃中贮存备用，有效期1个月。
6.3 样品检测
从包装袋中取出盐酸克伦特罗胶体金免疫层析快速检测卡，置于平整的台面上，检测卡应即开即用。
6.3.1 用塑料吸管（4.2.8）垂直滴加2滴（约30~60μL）无气泡上清液（6.1）于加样孔（S）内，每批需做阴性对照和阳性对照各一个，加样方法同待测品。
6.3.2 加样后5min时观察结果。

7 结果判断
7.1 有效性确认
7.1.1 阴性对照在检测区（T）出现显色条带（参见附录A，下同），所有阳性对照在检测区（T）均不出现显色条带，且质控区（C）出现一条显色条带，说明检测卡有效，可进行检测。
7.1.2 如阴性对照检测区（T）不出现显色条带，或阳性对照检测区（T）出现显色条带，或质控区（C）未出现一条显色条带，说明检测卡无效，不能进行检测。
7.2 测定结果
7.2.1 阳性（+）：仅质控区（C）出现一条显色条带，在检测区（T）内无显色条带出现。阳性结果表明：样本中含有盐酸克伦特罗且含量在检测限以上。
7.2.2 阴性（-）：两条显色条带出现。一条位于检测区（T）内，另一条位于质控区（C）内。阴性结果表明：样本中不含盐酸克伦特罗或其含量在检测限以下。
7.2.3 无效：质控区（C）未出现显色条带，表明本次检测无效（失效原因包括操作过程不当或检测卡已过有效期等）。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，更换检测卡重新检测。

8 结果确认
阳性样品应使用色谱质谱联用法进行确认。