ICS 65.020.20 B04 DB12 天津市地方标准 DB12/T 838-2018 辣椒种子纯度SSR分子标记鉴定方法 Method of identifying seed purity of pepper by using SSR-based marker 2018-11-07发布 2018-12-01实施 天津市市场和质量监督管理委员会 发布 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由天津市农村工作委员会提出并归口。 本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、天津市蔬菜研究中心、黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所。 本标准主要起草人：兰青周、吕敬刚、赵新、王成、兰璞、焦获、高素燕、陈锐、关海涛、张耀中、焦贺敏。 1 范围 本标准规定了辣椒种子纯度SSR分子标记鉴定方法的原理、仪器设备及试剂、方法步骤和纯度计算。 本标准适用于辣椒单交种的纯度鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本标准的应用是必不可少的。 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 3.1 种子纯度（seed purity） 指种子在SSR分子标记带型方面典型一致的程度，用具有本品种特异带型的种子粒数占鉴定样品种子粒数的百分率表示。 3.2 聚合酶链式反应（PCR） 在体外通过酶促反应扩增特异DNA片段的技术。 3.3 简单重复序列（SSR） 由1～6个核苷酸为重复单位组成的串联重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列。 3.4 分子标记（molecular marker） 以蛋白质或核酸分子的多态性为基础，用于鉴定生物遗传差异的标记。 4 原理 SSR广泛分布于辣椒基因组中，不同品种在重复单位数目上存在差异，从而形成多态性。利用PCR扩增SSR位点，通过电泳检测扩增产物，并根据电泳图谱进行种子纯度鉴定。 5 仪器设备及试剂 5.1 仪器设备 PCR仪、电泳槽（测序电泳槽、水平电泳槽）、高压电泳仪（3000V、400mA、400W）、电子天平、微量加样器、离心机、紫外-可见成像系统、恒温设备等。 5.2 试剂 EDTA-Na2、Tris、盐酸、SDS、NaCl、NaOH、硼酸、甲酰胺、溴酚蓝、丙烯酰胺、尿素、TEMED、过硫酸铵、乙醇、甲醛、Taq DNA聚合酶、dNTPs、SSR引物等。实验用水应符合GB/T 6682一级水标准。 5.3 溶液配制 相关溶液配制方法见附录A。 6 方法步骤 6.1 取样 按GB/T 3543.2进行分样与保存，从样品中随机取100粒以上种子，并取父母本材料各10份。 6.2 单粒种子DNA提取 6.2.1 样品预处理 在培养皿中铺棉花或滤纸，浸湿后均匀撒种子，覆盖纱布，在光照培养箱中培养。条件为16h 35℃光照、8h 28℃黑暗，待子叶长出备用。 6.2.2 DNA提取 取幼苗子叶置于离心管中液氮研磨。加入预热DNA提取液（65℃）400μL，65℃保温30min。加入氯仿-异戊醇（24:1），离心后取上清。加入预冷无水乙醇沉淀DNA，离心后用乙醇-乙酸铵洗涤沉淀，最终用TE缓冲液溶解DNA。 6.2.3 DNA的浓度和