DB51/T1302—2011 绵羊肺炎支原体PCR检测技术规范 ICS 11.220 B41 备案号：30905-2011 四川省地方标准 DB51/T1302—2011 Technical Specification for PCR Detection Method of Mycoplasma ovipneumoniae 发布单位：四川省质量技术监督局 发布日期：2011-06-27 实施日期：2011-07-01 前言 本标准由四川省畜牧食品局提出并归口，由四川省质量技术监督局批准发布。 本标准起草单位：西南民族大学、四川省畜禽繁殖改良总站。 本标准主要起草人：杨发龙、岳华、王永、汤承、傅昌秀。 本标准附录A为资料性附录。 1 范围 本标准规定了绵羊肺炎支原体的PCR（聚合酶链式反应）检测方法。 本标准适用于绵羊肺炎支原体的检测与鉴定。 2 规范性引用文件 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语与定义 3.1 聚合酶链式反应（PCR） 一种分子生物学技术，用于体外扩增特定DNA片段。 3.2 引物（primer） 人工合成的寡核苷酸序列，用于PCR扩增反应，两条引物分别与DNA模板两端互补结合。 4 设备和试剂 4.1 主要仪器设备 PCR扩增仪、电泳仪及水平电泳槽、凝胶成像系统、冷冻高速离心机、微量离心机、高压灭菌锅、恒温水浴锅及各类移液器（0.1–1000μL）。 4.2 主要试剂 4.2.1 引物（10 μmol/L） P1：5'-TGAACGGAATATGTTAGCTT-3' P2：5'-GACTTCATCCTGCACTCTGT-3' 4.2.2 DNA提取试剂 蛋白酶K、十二烷基硫酸钠（SDS）、酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇。 4.2.3 PCR反应试剂 Taq DNA聚合酶、MgCl₂、dNTP、10×PCR Buffer（无Mg²⁺）。 4.2.4–4.2.10 其他试剂 STE缓冲液、TAE电泳缓冲液、6×上样缓冲液、琼脂糖、溴化乙锭溶液、DNA分子量标准及符合GB/T 6682三级水要求的实验用水。 5 DNA提取 5.1 样本处理 5.1.1 组织样本：肺组织按1g加入1mL STE缓冲液研磨，离心后取上清再高速离心，取沉淀用于DNA提取。 5.1.2 棉拭子：鼻腔拭子浸入STE缓冲液30min，挤压混匀后离心，取沉淀用于DNA提取。 5.1.3 胸腔渗出液：与STE缓冲液等量混合后离心，取沉淀用于DNA提取。