DB32/T1775-2011 I型鸭肝炎病毒检测 RT-PCR方法 发布：2011-05-06 实施：2011-07-06 江苏省质量技术监督局发布 前言 为规范I型鸭肝炎病毒分子生物学检测技术，提高检测灵敏度、稳定性和特异性，特制定本标准。本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准结构和编写》编制，附录A为规范性附录。本标准由江苏省农业科学院提出，起草单位为江苏省农业科学院，起草人：魏雪涛、李银、刘宇卓、张敬峰。 1 范围 本标准规范了I型鸭肝炎病毒分子生物学检测技术RT-PCR的引物设计、样品范围、操作流程、反应条件等技术标准，适用于检测鸭肝脏和病毒尿囊液中的I型鸭肝炎病毒核酸。 2 规范性引用文件 - GB/T6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 - NY/T541-2002 动物疫病实验室检验采样 3 方法原理 聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大特定DNA片段的分子生物学技术，可视为体外的DNA复制。PCR技术具有快速、敏感和特异性高的优点，广泛应用于动物疫病检测。本标准选取DHV IV P1基因的保守序列，设计特异性引物，并经过PCR条件优化、特异性验证和敏感性测试，对DHV I的鉴定具有高准确性。 4 仪器设备与主要试剂 4.1 仪器设备：PCR仪、离心机、电泳槽、微量移液器、凝胶成像系统。 4.2 主要试剂：TRIZOL、氯仿、异丙醇、无水乙醇、DEPC处理灭菌双蒸水、AMV反转录酶、5×AMV Buffer、10 mmol/L dNTPs、RNA酶抑制剂、25 mmol/L MgCl2、EXTaq DNA聚合酶、10X EXTaq DNA聚合酶buffer、2.5 mmol/L dNTP、DNA Marker DL-2000、琼脂糖。 5 引物 上游引物：5'-ATCTAATGTCCCGATACAAGGTG-3' 下游引物：5'-ACGCTAGTGTTTTGAGTCTAAGGC-3' 6 样品采集 按照NY/T541-2002方法，从病死或扑杀鸭无菌采集肝脏组织。 7 方法步骤 7.1 样品处理 取病料0.5~1 g置研钵中剪碎并研磨，反复冻融研磨，用生理盐水1:5稀释，4℃ 12000 r/min离心10 min，取上清200 μL备用。 阴性对照：未发病正常鸭肝脏。 阳性对照：DHV阳性肝脏样品。 7.2 DHV RNA提取 取已处理样品，每管依次加入Trizol 600 μL，振荡混匀，室温放置10 min，加入氯仿 200 μL，振荡混匀，室温放置1 min，4℃ 12000 r/min离心15 min，取上层水相750 μL，加入500 μL 异丙醇，混匀，-20℃放置15 min，4℃ 12000 r/min离心15 min，去上清，加入75%乙醇1 mL洗涤，4℃ 8000 r/min离心5 min，去上清，室温干燥20 min，加入DEPC水10 μL溶解RNA样品。 7.3 RT-PCR反应 反转录反应：5×AMV Buffer 4 μL、10 mmol/L dNTPs 2 μL、下游引物1 μL、RNA酶抑制剂0.5 μL、RNA模板10 μL、AMV反转录酶0.5 μL、DEPC水 2 μL，总体积20 μL，混匀离心，65℃反应15 min，42℃孵育1 h，95℃ 5 min，同时设阴性、阳性对照，产物-20℃保存。 PCR反应：按25 μL体系进行，含MgCl2 1.5 μL，灭菌水 15 μL，反转录产物 4 μL，10X EXTaq DNA聚合酶buffer 2.5 μL，2 mmol/L dNTP 0.5 μL，上下游引物各 0.5 μL，EXTaq DNA聚合酶 0.5 μL，94℃ 3 min，进入循环：94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环，72℃延伸10 min。