ICS11.220 B41 DB37 山东省地方标准 DB37/T2843—2016 鸭坦布苏病毒双抗体夹心ELISA检测方法 Detection method on Duck Tembusu Virus by a double antibody sandwich ELISA 2016-09-18发布 山东省质量技术监督局 2016-10-18实施 前言 本标准按照GB/T1.1-2009规则起草，由山东省畜牧兽医局提出，并由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。标准起草单位为山东农业大学，主要起草人包括刁有祥、陈浩、唐熠、提金凤、冯强、欧全宾。 1 范围 本标准规定了鸭坦布苏病毒双抗体夹心ELISA方法的样品采集与保存、样品处理、试剂及仪器、检测步骤以及结果判定等内容。本方法适用于检测鸭组织、分泌物、排泄物和鸭胚尿囊液中的坦布苏病毒，也可用于鹅及其他动物的坦布苏病毒检测。 2 试剂及仪器 2.1 试剂 - 捕获单抗：抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体。 - 检测单抗：辣根过氧化物酶标记（HRP）的另一株抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体，简称酶标单抗。 - 阳性对照：坦布苏病毒鸭胚尿囊液。 - 阴性对照：SPF鸭胚尿囊液。 - 磷酸盐缓冲液（PBS）、包被液、洗涤液、样品稀释液、封闭液、底物溶液及终止液、甘油盐水（具体配方见附录A）。 2.2 仪器 - 酶标仪 - 微量加样器 - 恒温培养箱 - 聚苯乙烯板 - 水平振荡器 - 生物安全柜 3 样品准备 3.1 样品的采集和处理 3.1.1 样品采集 - 死亡鸭采集卵泡膜、脾和脑等组织，分别或同时处理。 - 活鸭采集咽喉或泄殖腔拭子。 3.1.2 样品保存 样品应放在含抗生素的pH值7.0～7.4等渗磷酸盐缓冲液中（无PBS可用25%～50%甘油盐水）。组织和拭子悬液中应含青霉素、链霉素、庆大霉素和制霉菌素。加入抗生素后，pH调至7.0～7.4。样品在室温下放置1-2小时内应尽快处理，无法及时处理的可在4℃保存24小时，或-70℃低温保存。 3.1.3 样品处理 在生物安全柜中进行。拭子置于200μL含抗生素的缓冲液中；组织样品取0.2g置于500μL缓冲液研磨，反复冻融三次，8000r/min离心5分钟，取上清液作为检测材料。 4 操作步骤 4.1 将试剂预温至20℃～25℃。 4.2 捕获单抗用包被液稀释至2.5ng/μL，每孔100μL加入96孔板，4℃孵育过夜。 4.3 用洗涤液洗板3次，每次在水平振荡器300r/min震荡3分钟，甩干残液。 4.4 每孔加入200μL封闭液，37℃孵育1小时，洗板。 4.5 A1、A2孔加100μL阴性对照，A3、A4孔加100μL阳性对照。 4.6 待检样品加入其他孔，每孔100μL，37℃孵育1小时，洗板。 4.7 酶标单抗按1:1000倍稀释，每孔100μL，37℃孵育1小时，洗板。 4.8 每孔加100μL底物溶液，37℃避光孵育15分钟。 4.9 每孔加50μL终止液，轻轻振荡终止反应。 4.10 450nm测定各孔吸光度（OD值），操作需30分钟内完成。 5 结果判定 5.1 阴性对照OD均值=(A1孔OD+A2孔OD)/2；阳性对照OD均值=(A3孔OD+A4孔OD)/2。 5.2 阳性对照平均值减阴性对照平均值须大于0.4，阴性对照平均值须≤0.20，否则需重做。 5.3 判定 - 阳性：样品液OD450nm≥0.40，表示含有坦布苏病毒。 - 阴性：样品液OD450nm≤0.20，表示不含坦布苏病毒。 - 可疑：0.20
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