ICS65.020.20 B04 DB12 天津市地方标准 DB12/T839—2018 茄子种子纯度SSR分子标记鉴定方法 Method of identifying seed purity of eggplant by using SSR-based marker 2018-11-07发布 天津市市场和质量监督管理委员会 2018-12-01实施 前言 本标准按照GB/T1.1—2009的规则起草，由天津市农村工作委员会提出并归口。标准起草单位为天津市农业质量标准与检测技术研究所、天津市蔬菜研究中心、黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所。主要起草人为兰青阔、王利英、赵新、王成、兰璞、乔军、刘婧、陈锐、关海涛、张耀中、焦贺敏。 1 范围 本标准规定了茄子种子纯度SSR分子标记鉴定方法的原理、仪器设备及试剂、方法步骤、纯度计算，适用于茄子单交种的纯度鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本标准的应用是必不可少的。注日期的引用文件仅适用于所注日期版本，不注日期的引用文件适用其最新版本，包括所有修改单。 - GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 - GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 3.1 种子纯度（Seed purity） 种子在SSR分子标记带型方面典型一致的程度，用具有本品种特异带型的种子粒数占鉴定样品种子粒数的百分率表示，以反映品种特征特性的一致性程度。 3.2 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR） 在体外通过酶促反应扩增特异DNA片段的技术。 3.3 简单重复序列（Simple Sequence Repeat, SSR） 由1～6个核酸为重复单位聚集而成的长达几十至几百bp的串联重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，高度多态性主要来源于串联数目的不同。 3.4 分子标记（Molecular Marker） 以蛋白质或核酸分子的多态性为基础，鉴定生物在遗传上的差异。 4 原理 SSR分布于茄子整个基因组，每个位点上重复单位的数目不同造成品种间的多态性。利用PCR技术扩增多态的SSR，通过电泳检测扩增产物，并利用电泳图谱进行茄子种子纯度鉴定。 5 仪器设备及试剂 5.1 仪器设备 PCR仪、测序电泳槽、水平电泳槽、高压电泳仪（3000V, 400mA, 400W）、万分之一电子天平、微量加样器、磁力搅拌器、台式离心机、紫外-可见成像系统、胶片观察灯、水平摇床、高压灭菌锅、pH计等。 5.2 试剂 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、盐酸（HCl, 36%）、十二烷基硫酸钠（SDS）、氯化钠（NaCl）、氢氧化钠（NaOH）、硼酸、去离子甲酰胺、溴酚蓝、二甲苯青FF、甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、尿素、亲和硅烷、剥离硅烷、无水乙醇、四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸铵、冰醋酸、硝酸银、甲醛溶液（37%）、Taq DNA聚合酶（含Mg的10X PCR缓冲液）、四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）、SSR引物、琼脂糖、GoldView染料、定性PCR试剂盒、DNA提取试剂盒、实验用水为重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。除特殊说明外，所用试剂均为分析纯。 5.3 溶液配制 相关溶液配制方法见附录A。 6 方法步骤 6.1 取样 检测样品的分样和保存应符合GB/T3543.2规定，从中随机取100粒以上种子，并取其父母本材料各10份。 6.2 单粒种子的DNA提取 6.2.1 样品预处理 在玻璃培养皿底部铺约3mm厚的棉花或滤纸，用水浸湿后均匀撒上检测样品，并在表面覆盖一层纱布，置于光照培养箱中。培养条件为16h 35℃光照、8h 28℃暗培养，待种子长出子叶后备用。 6.2.2 DNA提取 取单株幼苗子叶放入1.5mL离心管中，在液氮中研碎。将DNA提取液预热至65℃，每管加入400μL混合样品，置于65℃水浴30min后取出，加入400μL 24:1氯仿-异戊醇（V:V），振荡混匀。10000g离心10min，将上清液200μL转入新离心管，加入400μL 预冷-20℃无水乙醇沉淀DNA。10000g离心1min，弃上清液，加入500μL乙醇-乙酸铵溶液，6000g离心5min收集沉淀，加入100μL TE（pH8.0）溶解DNA。